李燕華 吳小芳 張利容 安銀華 鄧夏 劉玲玲 孫華

子宮肌瘤是由子宮平滑肌增生引起的良性腫瘤，是女性生殖器官常見疾病。子宮肌瘤多發(fā)于30～50歲女性，且發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，精神壓力大、環(huán)境衛(wèi)生差、內(nèi)分泌失調(diào)、晚育、妊娠、生殖道炎癥等均能影響子宮肌瘤發(fā)病[1]。有研究表明，子宮肌瘤是一種激素依賴性腫瘤，雌激素、孕激素均與子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2]。Grings等[3]研究報(bào)道，雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)在子宮肌瘤組織中過表達(dá)，促進(jìn)子宮平滑肌瘤生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)，降低ER水平可減小子宮肌瘤體積，有效抑制子宮肌瘤進(jìn)展[4]。Tsigkou等[5]研究證實(shí)，子宮肌瘤組織中孕激素受體(Progesterone Receptor，PR)表達(dá)水平明顯高于正常子宮肌層組織，與患者年齡、肌瘤數(shù)量有關(guān)，PR信號(hào)可能有利于子宮肌瘤生長(zhǎng)。PR拮抗劑可抑制子宮肌瘤增殖，可用于子宮肌瘤臨床治療[6]。有研究表明，miR-21在肝癌患者血清中高表達(dá)，與腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者5年生存率有關(guān)[7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-21表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)。然而miR-21在子宮肌瘤患者中作用尚未有研究，本研究通過檢測(cè)子宮肌瘤患者血清中miR-21表達(dá)水平，分析其與ER、PR表達(dá)水平及臨床病理特征關(guān)系，探究miR-21在子宮肌瘤中意義，為子宮肌瘤臨床治療提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年1月本院收治的子宮肌瘤患者118例，患者年齡29～61歲，平均(47.63±8.54)歲。入組患者按組織學(xué)分型分為：肌壁間肌瘤37例，漿膜下肌瘤42例，黏膜下肌瘤39例。另選擇同期因子宮脫垂行子宮切除術(shù)患者118例作為正常子宮肌層組，年齡28～60歲，平均(47.02±8.31)歲。2組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床及病理切片診斷為子宮肌瘤且需行子宮肌瘤切除術(shù)者；② 3個(gè)月內(nèi)未使用激素類藥物；③患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有糖尿病、甲狀腺功能異常類疾病者；②合并患有惡性腫瘤者；③患有嚴(yán)重精神疾病者。

1.3 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號(hào)：JL1256，德國(guó)Qiagen公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：205311，德國(guó)Qiagen公司)、實(shí)時(shí)熒光定量(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：208054，德國(guó)Qiagen公司)、兔抗人ER多克隆抗體(貨號(hào)：ABP0086，Abbkine生物技術(shù)有限公司)、兔抗人PR多克隆抗體(貨號(hào)：ABP55583，Abbkine生物技術(shù)有限公司)、羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：QN2732-PWV，北京百奧萊博科技有限公司)、免疫組織化學(xué)染色試劑盒(貨號(hào)：YDJ4123，上海羽朵生物科技有限公司)、qRT-PCR儀(型號(hào)：7500 Fast，美國(guó)ABI公司)、光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：DCM8，德國(guó)徠卡公司)。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集:術(shù)前清晨7∶00～9∶00采集所有入組者空腹時(shí)外周靜脈血，3 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于無菌EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?。術(shù)中分別收集子宮肌瘤患者子宮肌瘤組織及子宮脫垂患者正常子宮肌層組織，液氮迅速冷凍后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 qRT-PCR檢測(cè)血清中miR-21、ER mRNA、PR mRNA表達(dá)水平:使用試劑盒提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，進(jìn)行qRT-PCR。20 μl反應(yīng)體系如下：SYBR Green PCR Mix 10 μl、ROX Dye 0.1 μl、上、下游引物各2 μl、cDNA 2 μl、RNase-free水3.9 μl。反應(yīng)步驟如下：95℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 10 s，38個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-21、ER mRNA、PR mRNA相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織中ER、PR蛋白水平:按照免疫組化染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最終切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，并選取400倍鏡下5個(gè)視野進(jìn)行ER、PR蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞核中呈棕黃色或棕褐色為ER蛋白陽性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色或棕褐色為PR蛋白陽性細(xì)胞。染色結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：按照染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比記分。①染色強(qiáng)度：無色為、淡黃色為、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分。②陽性細(xì)胞所占百分比：<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記為0分、1分、2分、3分、4分。兩者記分相乘，≤3分為陰性表達(dá)，>3分為陽性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 2組miR-21、ER mRNA、PR mRNA表達(dá)水平比較 miR-21、ER mRNA、PR mRNA在子宮肌瘤組患者血清中表達(dá)水平均顯著高于正常子宮肌層組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組miR-21表達(dá)水平比較

2.2 2組ER、PR蛋白表達(dá)水平比較 ER蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核中，PR蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。ER蛋白、PR蛋白在子宮肌瘤組織中陽性表達(dá)率均顯著高于正常子宮肌層組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 2組ER、PR蛋白表達(dá)水平比較 n=118，例

ER蛋白陽性表達(dá) ER蛋白陰性表達(dá) PR蛋白陽性表達(dá) PR蛋白陰性表達(dá)

2.3 子宮肌瘤患者miR-21表達(dá)水平比較 ER陰性組miR-21表達(dá)水平顯著低于ER陽性組(P<0.05)，PR陰性組miR-21表達(dá)水平顯著低于PR陽性組(P<0.05)。見表4。

表4 不同ER、PR表達(dá)組子宮肌瘤患者miR-21水平比較

2.4 不同水平miR-21、ER、PR子宮肌瘤患者臨床病理特征比較 子宮肌瘤患者血清miR-21及子宮肌瘤組織ER蛋白、PR蛋白表達(dá)水平均與年齡、肌瘤直徑、組織學(xué)分型無關(guān)(P>0.05)，與肌瘤數(shù)目、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)周期有關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 不同水平miR-21、ER、PR子宮肌瘤患者臨床病理特征比較 例

2.5 子宮肌瘤患者血清miR-21與ER mRNA、PR mRNA相關(guān)性 子宮肌瘤患者血清miR-21表達(dá)水平與ER mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.422，P=0.000)，與PR mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.419，P=0.000)。見圖2、3。

圖2 子宮肌瘤患者血清miR-21與ER mRNA水平相關(guān)性

圖3 子宮肌瘤患者血清miR-21與PR mRNA水平相關(guān)性

3 討論

子宮肌瘤患者多無明顯癥狀，但多數(shù)患者可能伴有白帶異常、痛經(jīng)、貧血、腹部包塊、子宮出血等，影響患者日常生活質(zhì)量。雖然子宮肌瘤為良性腫瘤，但也有惡變可能，需引起患者重視[9]。目前關(guān)于影響子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中相關(guān)因素尚不明確，探尋相關(guān)因子調(diào)控作用對(duì)控制子宮肌瘤病情發(fā)展，改善患者生活質(zhì)量有一定意義。

人體內(nèi)雌激素由人卵巢和胎盤分泌，能促進(jìn)女性第二性征發(fā)育及性成熟，與人體生長(zhǎng)、內(nèi)分泌及心血管代謝密切相關(guān)。雌激素分泌持續(xù)易在短時(shí)間內(nèi)引起子宮內(nèi)膜增生過多，進(jìn)而引發(fā)子宮肌瘤。人體內(nèi)孕激素由卵巢黃體細(xì)胞分泌，能抑制排卵、促進(jìn)乳腺腺泡生長(zhǎng)、松弛血管及促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，與雌激素作用相似，二者存在相互作用[10]。雌激素、孕激素均可分別與ER、PR特異性結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。Le?o等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與萎縮的子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜息肉中ER、PR表達(dá)水平增加。M?kinen等[12]研究表明，子宮肌瘤組織中ER、PR呈陽性，ER、PR水平能在一定程度上為臨床靶向治療和病情改善提供一定依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，與正常子宮肌層組織相比，ER蛋白、PR蛋白在子宮肌瘤組織中陽性表達(dá)率均顯著升高，與M?kinen等[12]研究結(jié)果一致，提示ER、PR表達(dá)水平變化與子宮肌瘤發(fā)生有關(guān)。研究報(bào)道，ER、PR表達(dá)與子宮體積變化有關(guān)[13]。ER蛋白在子宮內(nèi)膜增生期表達(dá)明顯高于分泌期[14]。Mohammed等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ER在可通過靶向PR基因，影響乳腺癌臨床病理特征。本研究發(fā)現(xiàn)，與肌瘤數(shù)目、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)周期有關(guān)，提示ER、PR與子宮肌瘤進(jìn)展有關(guān)，ER、PR可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，引起子宮內(nèi)膜增生，影響子宮肌瘤增多及體積增大，促進(jìn)子宮肌瘤發(fā)展。

有研究表明，子宮內(nèi)膜癌患者血清中miR-21表達(dá)水平顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織，與浸潤(rùn)深度、病灶大小有關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，miR-21在子宮肌瘤患者血清中表達(dá)水平顯著高于正常子宮肌層組，與蔡如玉等[16]在子宮內(nèi)膜癌中研究結(jié)果相似，提示miR-21可能與子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有研究報(bào)道，miR-21可促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[17]。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21上調(diào)可促進(jìn)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，子宮肌瘤患者血清中miR-21表達(dá)水平與肌瘤數(shù)目、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)周期有關(guān)，提示子宮肌瘤中miR-21表達(dá)影響子宮肌瘤進(jìn)展。

有研究表明，乳腺癌組織中miR-181a、miR-23、miR-26表達(dá)水平均顯著低表達(dá)，PR陽性患者三者表達(dá)水平均顯著低于PR陰性患者，過表達(dá)三種miRNA可下調(diào)PR mRNA表達(dá)[19]。張廣平等[20]研究報(bào)道，miR-200a可通過靶向ER抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)。以上研究提示miRNA可通過靶向ER、PR促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，影響腫瘤進(jìn)程。Petrovic等[21]研究發(fā)現(xiàn)，ER、PR陽性乳腺癌患者miR-21水平高于ER、PR陰性乳腺癌患者，患者miR-21水平與ER、PR水平呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，子宮肌瘤患者血清中，與ER、PR陰性組相比，ER、PR陽性組患者miR-21表達(dá)水平顯著升高，與Petrovic等在乳腺癌中研究結(jié)果一致，提示miR-21與ER、PR可能存在相互作用機(jī)制，共同參與子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展。但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，子宮肌瘤患者血清中miR-21、ER、PR表達(dá)水平均顯著升高，三者表達(dá)水平均與與肌瘤數(shù)目、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)周期有關(guān)。miR-21表達(dá)水平均與ER、PR水平呈正相關(guān)，三者間可能相互作用，共同影響子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展。但由于本研究方法較為基礎(chǔ)，樣本量較少，三者機(jī)體協(xié)同表達(dá)機(jī)制還需大量樣本和實(shí)驗(yàn)深入研究。