譚玉娥 劉鑫

胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。在早期發(fā)現(xiàn)胃癌通常是可治愈的，其5年生存率>90%，而晚期胃癌的預(yù)后仍然較差[1]。胃癌篩查是發(fā)現(xiàn)早期胃癌的主要手段，其中內(nèi)鏡檢查，由于具有較高的準(zhǔn)確性，被廣泛應(yīng)用于胃癌的早期診斷；此外放大內(nèi)窺鏡加上窄帶成像(NBI)在早期胃癌的診斷中的應(yīng)用，進(jìn)一步提高了診斷的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性[2]。但內(nèi)鏡檢查需依賴內(nèi)鏡醫(yī)師的觀察技能，具有一定局限性，同時(shí)內(nèi)鏡檢查存在5%～19%的假陰性率，也容易發(fā)生胃癌的漏診[3]。目前一些血清生物標(biāo)志物被用于早期胃癌的篩選，例如糖類抗原CA19-9 和癌胚抗原CEA，然而，這些腫瘤標(biāo)志物的敏感度和特異性仍然較低[4,5]。因此，迫切需要鑒定新的生物標(biāo)志物以進(jìn)行更為準(zhǔn)確的胃癌的早期診斷。已有文獻(xiàn)報(bào)道指出，一些腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子甲基化過(guò)高與胃癌易感性相關(guān)[6]，與胃癌患者的正常組織相比，許多基因在癌變組織中甲基化[7,8]。目前結(jié)合全基因組、表觀基因組和基因特異性DNA甲基化分析其在胃癌早期診斷中的應(yīng)用仍鮮有報(bào)道。因此本研究結(jié)合總體、表觀基因組和基因特異性DNA甲基化分析進(jìn)行第一階段生物標(biāo)記物開發(fā)研究，以檢驗(yàn)基因特異性啟動(dòng)子甲基化生物標(biāo)記物以及總體DNA甲基化指數(shù)(GDMI)是否能夠在內(nèi)鏡活檢中將胃癌患者與對(duì)照組區(qū)別開來(lái)，為胃癌早期篩查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究選取2014至2018年我院358例高風(fēng)險(xiǎn)胃癌患者，所有患者接受了內(nèi)鏡診斷和活檢。胃炎對(duì)照組的入選標(biāo)準(zhǔn)為患者出現(xiàn)十二指腸胃炎癥狀，入選標(biāo)準(zhǔn)為根據(jù)胃癌的臨床診斷，這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均由病理學(xué)家確定。其中，282例患者的DNA樣本可以進(jìn)行進(jìn)一步分析。將納入研究的參與者隨機(jī)分為3組：發(fā)現(xiàn)組1用于GDMI分析；發(fā)現(xiàn)組2用于表觀全基因組和基因特異性DNA甲基化分析；驗(yàn)證組用于GDMI和基因特異性啟動(dòng)子DNA甲基化分析。研究中所有患者獲得知情同意書，且該研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。共有282例患者，符合入選標(biāo)準(zhǔn)，納入本研究，平均年齡(62.5±14.8)歲。發(fā)現(xiàn)組和驗(yàn)證組患者年齡、性別比、臨床表現(xiàn)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。150例胃炎患者納入對(duì)照組，其中男92例，女52例；平均年齡(53.4±12.3)歲；幽門螺桿菌陽(yáng)性81例，發(fā)生化生34例。見表1。

表1 患者基線臨床特征

1.2 方法

1.2.1 組織樣本和DNA提取:活檢組織從患者的癌變處和對(duì)照組的胃竇處獲得，保存于-70℃。胃黏膜組織采用10%甲醛緩沖液固定，石蠟包埋，顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)檢查。使用Sydney系統(tǒng)對(duì)蘇木精和伊紅染色的組織切片進(jìn)行評(píng)分(Lash，2013年)，采用PAS染色顯示腸化生的活檢。用沃辛星銀染色法鑒別幽門螺桿菌病變。本研究所用腫瘤組織經(jīng)組織病理學(xué)分類為胃腺癌組織。使用qAMP DNA迷你試劑盒(德國(guó)QIAGEN)從冷凍組織樣本中提取DNA，保存于-20℃。

1.2.2 總體DNA甲基化分析:使用MDQ1，Imprint?甲基化DNA定量試劑盒(Sigma，美國(guó))，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定總體DNA甲基化水平。并使用450 nm(A450)處吸光度讀數(shù)的平均值進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣本的GDMI按照以下公式計(jì)算：(A450av樣本-A450av空白)/(A450av對(duì)照-A450av空白)×100%。

1.2.3 表觀基因組DNA甲基化分析:采用人甲基化450K DNA 微珠芯片陣列進(jìn)行無(wú)偏差表觀全基因組DNA甲基化分析。亞硫酸氫鹽外延試劑盒(德國(guó)QIAGEN)進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA(2 μg)。將亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA雜交到人甲基化450K DNA微珠芯片陣列，以識(shí)別樣本中的不同甲基化區(qū)域(DMRs)。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，我們進(jìn)行了一個(gè)無(wú)偏差的表觀全基因組DNA甲基化分析，以確定胃癌樣本(n=298)中的DMRs，這些樣本來(lái)自TCGA和胃炎對(duì)照組(n=23)。用Illuminaio包將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R。對(duì)于數(shù)據(jù)歸一化，使用minfi包應(yīng)用noob背景減法和染色偏差校正，然后進(jìn)行歸一化和使用minfi中的bump-hunting方法識(shí)別病例和對(duì)照組間的DMRs。

1.2.4 基因特異性DNA甲基化分析:從表觀全基因組分析得到的DMR列表(P<0.05)中選擇了4個(gè)在DMR窗口中變異較大且CPGs數(shù)量最多的基因：interfer調(diào)節(jié)因子4(IRF4)；編碼吞噬和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(ELMO1)；含帽-甘氨酸結(jié)構(gòu)域的連接蛋白家族成員4(CLIP4)；以及編碼肌蛋白(MSC)。根據(jù)前面描述的方法[9]，設(shè)計(jì)了引物和探針，用熒光定量甲基化特異性PCR(QMSP)定量這4個(gè)基因的啟動(dòng)子甲基化。

1.2.5 生物標(biāo)志物開發(fā)流程:采用總體DNA甲基化分析法建立總體DNA甲基化指數(shù)(GDMI)。表觀全基因組陣列被用來(lái)鑒定癌癥中不同甲基化的基因特異性啟動(dòng)子區(qū)域，可以用甲基化特異性PCR定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Stata13(美國(guó)得克薩斯州Statacorp)進(jìn)行分析和管理，采用t檢驗(yàn)或方差進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體DNA甲基化和胃癌

2.1.1 在沒有發(fā)生化生的胃炎患者(平均值=5.69)、發(fā)生化生的胃炎患者(平均值=4.68)和胃癌患者(平均值=3.36)中，總體DNA甲基化與胃癌呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。比較沒有化生的胃炎患者和胃癌患者的總體DNA甲基化(P<0.01)。見圖1。

圖1 非化生胃炎患者、化生胃炎患者和胃腺癌患者中的GDMI結(jié)果

2.1.2 在發(fā)現(xiàn)組(n=60)的隨機(jī)患者中確定了與胃炎相關(guān)的總甲基化≥6.5，以評(píng)估高風(fēng)險(xiǎn)胃癌臨床中的GDMI。在驗(yàn)證組(n=135)中使用該標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定胃癌病例，敏感性為84.65%，特異性為31.75%，陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為85.86%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)為31.12%(P=0.021)。用同樣的GDMI標(biāo)準(zhǔn)(臨界值)來(lái)確定化生 ≥ 10%的病例時(shí)，敏感性為86.76%，特異性為35.43%，陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為95.65%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)為15.86%(P=0.089)。當(dāng)GDMI閾值提高至9時(shí)，對(duì)胃癌病例靈敏度和隱形預(yù)測(cè)值可達(dá)到100%。見表2。

表2 GDMI在內(nèi)鏡活檢中對(duì)胃炎和胃癌患者檢測(cè)結(jié)果 %

2.2 表觀基因組DNA甲基化分析

2.2.1 胃癌和胃炎患者表觀基因組甲基化對(duì)比分析:對(duì)胃炎患者(n=23)和胃癌患者(n=11)進(jìn)行比較，通過(guò)表觀全基因組DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)了250個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DMRs(P<0.05)。DMR主要分布在6號(hào)染色體(11%)，其次是1號(hào)染色體(10%)、19號(hào)染色體(8%)、2號(hào)染色體(7%)、7號(hào)染色體(6%)和5號(hào)染色體(6%)。其他染色體的DMRs均未超過(guò)5%。發(fā)現(xiàn)的DRMs主要分布于基因組的以下區(qū)域：基因內(nèi)部215個(gè)DMRs(42%)；啟動(dòng)子區(qū)域91個(gè) DRMs(19%)；重疊區(qū)域83個(gè)DMRs(16%)；TSS下游56個(gè)DMRs(11%)；TSS上游56個(gè)DMRs(11%)。每個(gè)DMR的單個(gè)CpG數(shù)量在1～18。大部分(98%)DMR的CpG數(shù)低于10。超過(guò)10個(gè)GpC的DRMs分布于第1外顯子的下游區(qū)域(15 DMRs)、外顯子的內(nèi)部區(qū)域(6 DMRs)、外顯子的覆蓋區(qū)域(3 DMRs)、第1外顯子的上游區(qū)域(2 DMR)、內(nèi)含子的內(nèi)部區(qū)域(1 DMR)和2個(gè)外顯子的重疊區(qū)域(1 DMR)中。

2.2.2 在TCGA樣本中使用bump-hunting的表觀基因組DNA甲基化分析:對(duì)TCGA樣本中的正常樣本(n=12)和癌癥樣本(n=298)進(jìn)行表觀全基因組DNA甲基化分析，共發(fā)現(xiàn)350個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DMRs(P<0.05)。大多數(shù)DMR位于1號(hào)染色體(11%)，其次是6號(hào)染色體(9%)和2號(hào)染色體(8%)。DMRs存在于基因組的以下區(qū)域：在基因內(nèi)部67 DMRs(53%)；啟動(dòng)子區(qū)域30 DMRs(23%)；重疊5’區(qū)域15DMRs(12%)；TSS下游10 DMRs(7%)；TSS上游6 DMRs(4%)。每個(gè)DMR的單個(gè)CpG數(shù)量在1～10。大多數(shù)低于4(95%)。超過(guò)4個(gè)CpG的DMR位于第1個(gè)外顯子的下游區(qū)域重疊(9 DMRs)，外顯子內(nèi)(5 DMRs)，內(nèi)含子內(nèi)(3 DMRs)，覆蓋外顯子(1 DMR)。

2.3 與胃癌相關(guān)的DMR基因特異性DNA甲基化和TCGA數(shù)據(jù)集 用定量甲基化特異PCR(quantitative methylation specific PCR，qMSP)確定了135個(gè)樣本中及TCGA樣本集共有的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DMRs(P<0.05)中有4個(gè)啟動(dòng)子甲基化：IRF4、ELMO1、CLIP4和MSC。在散點(diǎn)圖的X軸上看到的基因組坐標(biāo)幾乎沒有差異，這些散點(diǎn)圖通過(guò)對(duì)我院患者樣本和TCGA樣本的兩個(gè)單獨(dú)的表觀全基因組分析說(shuō)明ELMO1和MSC具有顯著性。從無(wú)化生胃炎到化生胃炎，再到胃腺癌的組織學(xué)進(jìn)程中，IRF4(P<0.01)、ELMO1(P<0.01)、CLIP4(P<0.01)和MSC(P<0.01)的啟動(dòng)子甲基化與疾病的加重程度密切相關(guān)。這些結(jié)果表明IRF4、ELMO1、CLIP4和MSC的啟動(dòng)子甲基化可能是胃癌CpG島甲基化表型(CIMP)的一部分。見圖2、3。

圖2 不同樣本DMRs分布結(jié)果

2.4 具有基因特異性甲基化的預(yù)測(cè)模型 我們?cè)诎l(fā)現(xiàn)組(n=87)的數(shù)據(jù)集中使用與胃癌相關(guān)的基因特異性甲基化來(lái)估計(jì)使用IRF4、ELMO1、CLP4或MSC的單獨(dú)篩選模型來(lái)分類驗(yàn)證集中被確定為具有高胃癌基礎(chǔ)風(fēng)險(xiǎn)的參與者。在GDMI < 6.5時(shí)，正確分類率達(dá)到73%。見表3。

表3 使用IRF4、ELMO1、CLIP4或MSC預(yù)測(cè)GC風(fēng)險(xiǎn)的模型的優(yōu)勢(shì)比和系數(shù)

2.5 內(nèi)鏡誤診樣本GDMI分析 胃癌患者的總體DNA甲基化水平明顯低于胃炎對(duì)照組(P=0.002)。對(duì)照組平均GDMI為5.7(95% CI，4.93～6.41)，胃癌患者平均GDMI為3.7(95% CI,2.99～4.39)。深度炎癥與總體DNA低甲基化有關(guān)，這是癌癥的1個(gè)標(biāo)志。GDMI能夠根據(jù)炎癥深度識(shí)別胃炎患者(P=0.01)?；加袦\表炎癥的胃炎患者的平均GDMI為6.52(95% CI，5.4～7.6)，而患有深度炎癥的患者的GDMI為4.75(95%CI，3.84～5.67)。此外，在患有深度炎癥的胃炎患者中，當(dāng)比較有腸化生或無(wú)腸化生的患者時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)GDMI與此有顯著相關(guān)性(P=0.03)。與未發(fā)生腸化生的胃炎患者(平均值=5.4，95% CI，3.88～6.83)相比，患有深度炎癥和腸化生的胃炎患者的總體DNA甲基化水平顯著降低(P=0.03)(平均值=3.6，95%CI，2.65～4.63)。見圖4。

圖3 基因特異性啟動(dòng)子甲基化在不同組患者中的箱線圖結(jié)果

圖4 不同類型患者GDMI對(duì)比結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)合胃癌總體DNA、表觀基因組DNA和基因特異性DNA甲基化分析研究?jī)?nèi)鏡活檢后的胃癌高風(fēng)險(xiǎn)患者。結(jié)果表明，CLIP4、IRF4、ELMO1和MSC的啟動(dòng)子甲基化并且GDMI > 4，是內(nèi)鏡活檢中胃癌風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)中有效分子指標(biāo)。

CLIP4是T細(xì)胞泛素配體家族的成員，抑制T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，CLIP4可以促進(jìn)T細(xì)胞中生長(zhǎng)因子的提取誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)T細(xì)胞受體、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體和血小板衍生生長(zhǎng)因子β受體等各種活化的靶受體的積累[10]。有研究表明胃癌中的CLIP4是甲基化的。IRF屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，在各種基因(如干擾素、白介素、MHC Ⅰ/Ⅱ類)、凋亡和分化/成熟的調(diào)節(jié)中起到重要作用[11]。ELMO1在惡性膠質(zhì)瘤中起到促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用，ELMO1啟動(dòng)子甲基化作用在人類結(jié)直腸癌、腎病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中也有報(bào)道[12]。MSC基因編碼的肌蛋白作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在體內(nèi)也和E2A蛋白形成異二聚體，抑制E2A蛋白E47在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的激活能力[13]。

本研究探究了GDMI作為胃癌發(fā)生的生物標(biāo)志物的作用。胃癌活檢中觀察到的低GDMI水平，胃癌上皮發(fā)育不良和黏膜內(nèi)癌組織的LINE-1甲基化水平明顯低于相鄰的正常胃癌組織，與之前研究結(jié)果[14]一致。LINE-1是總體DNA甲基化的一個(gè)替代標(biāo)記，它測(cè)量基因組中一組重復(fù)元件的甲基化。GDMI比LINE-1更能反映總體DNA甲基化水平，因?yàn)樗芰炕麄€(gè)人類基因組中的DNA甲基化。本研究進(jìn)一步表明，GDMI可以鑒別不同程度炎癥和化生的胃炎患者。這一有趣的分子差異表明，僅根據(jù)胃黏膜上皮細(xì)胞的總體DNA甲基化水平，就有可能區(qū)分不同程度的胃炎嚴(yán)重程度、腸化生及胃腺癌。

GDMI可以區(qū)分炎癥的深度，因?yàn)榛加猩疃妊装Y的胃炎患者的GDMI比患有淺表炎癥的患者低，這表明在分子水平上，這些患者可能是胃癌最容易發(fā)展的患者。我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)比腸化生<或>10%的患者，腸化生>10%的患者GDMI較低(P=0.013)。對(duì)胃炎患者最初被內(nèi)鏡檢查者診斷為癌癥，其GDMI值低于胃炎患者，這類患者被內(nèi)鏡檢查者和病理學(xué)家歸類為胃炎患者。此外，這些胃炎患者誤診為癌癥患者的內(nèi)鏡下有類似的總體DNA甲基化概況腺癌患者。這些數(shù)據(jù)支持這樣一種觀點(diǎn)，即誤診病例具有潛在的致癌分子過(guò)程，最有可能惡化為癌癥。

目前只有少數(shù)研究本身檢查了胃癌的總體DNA低甲基化，理由是低甲基化是最早的表觀基因組事件，意味著從正常表型向惡性表型的轉(zhuǎn)變。雖然導(dǎo)致癌癥甲基化模式整體缺失的確切機(jī)制仍有待闡明，但很明顯，在胃癌發(fā)生的早期階段，總體DNA低甲基化已經(jīng)存在，并可能在生物學(xué)上發(fā)揮各種作用。胃癌病變進(jìn)展中，全基因組的低甲基化和區(qū)域高甲基化已經(jīng)被證明發(fā)生在1個(gè)擴(kuò)大的折疊胃炎，也可能有助于擴(kuò)散型胃癌的腫瘤發(fā)生[15]。總之，這些研究表明，GDMI可能是胃癌發(fā)生和發(fā)展中重要早期細(xì)胞事件的表觀基因組反映。我們后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步分析與信號(hào)通路中過(guò)度及欠表達(dá)相關(guān)的特定基因位點(diǎn)的甲基化差異，以及這些基因如何與其他類型的癌癥相匹配，這些都可能成為精確醫(yī)學(xué)時(shí)代新的診斷工具。