李靜 劉琴 柯錦

人類黑色素瘤是皮膚腫瘤中常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年，全球皮膚黑色素瘤新增病例為287 723例，死亡病例達(dá)60 712例[1]。黑色素瘤具有高度侵襲性，近1/3的黑色素瘤患者將經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)，大多數(shù)復(fù)發(fā)最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病[2]。然而，黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移機(jī)制仍不清楚。因此，需要進(jìn)一步的研究來闡明黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，以開發(fā)有希望的治療方法。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在組織和細(xì)胞中特異性表達(dá)。迄今為止，已經(jīng)確定了多個(gè)在黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用的miRNA，以及參與細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的miRNA[3,4]，如miR-150-5p[5]、miR-27a[6]、miR-1297[7]、miR-22[8]，miRNA可能是黑色素瘤的有效治療靶點(diǎn)。既往研究表明，微小RNA-582-5p(microRNA-582-5p，miR-582-5p)在人子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)顯著降低，miR-582-5p的上調(diào)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。miR-582-5p通過靶向調(diào)控絲氨酸/蘇氨酸激酶3(serine/threonine kinase 3，AKT3)抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[10]。上調(diào)miR-582-5p抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和侵襲[11]。但miR-582-5p在黑色素瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能尚未明確。MiR-29a通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)的甲基化來抑制宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]，SOCS1基因沉默抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞和人胰腺癌細(xì)胞增殖[13,14]?；诖?，本研究在體外培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞，觀察miR-582-5p對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、EMT的影響及對SOCS1的靶向關(guān)系，以探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人黑色素瘤細(xì)胞株(A375、G361、WM35、M14)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，人類皮膚黑色素細(xì)胞(NHEM)、Melanocyte Growth Medium培養(yǎng)基購自瑞士LONZA公司，RPMI-1640培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute)購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，miR-582-5p、anti-miR-582-5p、pcDNA-SOCS1購自武漢淼靈生物科技有限公司，SOCS1、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β肌動蛋白(β-actin)購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自Abcam公司，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,Annexin Ⅴ-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞A375、G361、WM35、M14培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，NHEM細(xì)胞培養(yǎng)于Melanocyte Growth Medium培養(yǎng)基，均在37℃、5%CO2的飽和濕潤培養(yǎng)箱中生長。

1.3 RNA提取和qPCR反應(yīng) 為了量化miR-582-5p和SOCS1 mRNA表達(dá)，使用TRIzol提取A375、G361、WM35、M14、NHEM細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，接下來進(jìn)行qPCR。U6和β-actin分別用作miR-582-5p和SOCS1 mRNA表達(dá)的內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法定量相對基因表達(dá)。引物序列如下：miR-582-5p正向5’-GCGGTTACAGTTGTTCAACC-3’，反向5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；內(nèi)參U6正向5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；SOCS1正向5’-TGCGCCTCAAGACCTTCAG-3’，反向5’-CATCAGGCTCTCGCTTTTGGA-3’；內(nèi)參β-actin正向5’-GTATCCTGACCCTGAAGTACC-3’，反向5’-TGAAGGTCTCAAACATGATCT-3’。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集處于指數(shù)生長期的A375細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染前1 d以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板中。細(xì)胞密度達(dá)約70%時(shí)，根據(jù)制造商的方案，將miR-582-5p、anti-miR-582-5p、pcDNA-SOCS1使用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，收獲轉(zhuǎn)染的A375細(xì)胞，分別用于后續(xù)檢測。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析 將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌2次，并用RIPA裂解液裂解。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)(10%凝膠)分離等量的總蛋白質(zhì)(20 μg)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h后，將膜在4℃下與SOCS1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin一抗孵育過夜。用含有Tris緩沖鹽的Tween-20溶液(tris buffered saline with Tween-20，TBST)充分洗滌后，在室溫下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h。最后，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液使免疫反應(yīng)蛋白可視化。β-actin用作內(nèi)參蛋白。

1.6 細(xì)胞增殖檢測 使用噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)評估A375細(xì)胞增殖的影響。收集轉(zhuǎn)染的A375細(xì)胞，并將1×105個(gè)/ml密度的細(xì)胞接種到96孔板中。在37℃，5%CO2下孵育24、48、72 h后，通過向每孔細(xì)胞中加入20 μl MTT溶液進(jìn)行MTT測定，然后將細(xì)胞在37℃孵育4 h，加入150 μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，37℃孵育10 min，最后，使用酶標(biāo)儀測定波長490 nm的吸光度(OD 490 nm)。

1.7 細(xì)胞凋亡測定 根據(jù)Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明，通過流式細(xì)胞儀分析A375細(xì)胞凋亡。調(diào)整轉(zhuǎn)染后的A375細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測。

1.8 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)

1.8.1 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：用于鑒定A375細(xì)胞的遷移能力，收獲轉(zhuǎn)染后的A375細(xì)胞并懸浮在不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，總計(jì)5×104個(gè)細(xì)胞置于Transwell上室。將含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑添加至Transwell下室。孵育24 h后，使用棉簽輕輕擦去非遷移性細(xì)胞。將遷移性細(xì)胞用4%甲醛在37℃固定15 min，并用0.1%結(jié)晶紫在37℃染色30 min，統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.8.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：用于鑒定A375細(xì)胞的侵襲能力，事先用50 μl與無血清培養(yǎng)基混勻的Matrigel包被Transwell上室，靜置3～4 h。其余步驟同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 生物信息學(xué)分析和熒光素酶報(bào)告基因測定 數(shù)據(jù)庫TargetScan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測出SOCS1是miR-582-5p的靶標(biāo)之一。分別構(gòu)建SOCS1的野生型(WT)和突變型(MUT)3’非編碼區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)質(zhì)粒，標(biāo)記為WT-SOCS1、MUT-SOCS1，利用Lipofectamine 2000將miR-582-5p或miR-con共轉(zhuǎn)染入A375細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h測定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-582-5p 和SOCS1在人黑色素瘤細(xì)胞和人類皮膚黑色素細(xì)胞中的表達(dá) qPCR檢測數(shù)據(jù)顯示，miR-582-5p在人黑色素瘤細(xì)胞株A375、G361、WM35、M14細(xì)胞中的表達(dá)量明顯低于人類皮膚黑色素細(xì)胞NHEM細(xì)胞(P<0.05)，選擇miR-582-5p表達(dá)量最低的A375細(xì)胞開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對SOCS1 mRNA和SOCS1蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果表明，A375、G361、WM35、M14細(xì)胞中SOCS1 mRNA和SOCS1蛋白表達(dá)量顯著高于NHEM細(xì)胞(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western blot檢測黑色素瘤細(xì)胞和人類皮膚黑色素細(xì)胞中SOCS1的表達(dá)

表1 miR-582-5p 和SOCS1在人黑色素瘤細(xì)胞及人類皮膚黑色素細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 miR-582-5p過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞A375增殖和細(xì)胞凋亡的影響 在A375細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-582-5p，其表達(dá)量較miR-con組大幅升高(P<0.05)。MTT對A375細(xì)胞增殖的檢測結(jié)果表明，與miR-con組比較，miR-582-5p過表達(dá)對24 h的細(xì)胞活性無明顯影響，而顯著降低48 h、72 h的細(xì)胞活性(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測A375細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，miR-582-5p過表達(dá)較miR-con組明顯提高細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 miR-582-5p過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡的影響

表2 miR-582-5p過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞A375增殖和凋亡的影響

2.3 miR-582-5p過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞A375遷移和侵襲的影響 Transwell小室法檢測細(xì)胞A375遷移和侵襲，結(jié)果表明，與miR-con組比較，miR-582-5p過表達(dá)明顯減少遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)(P<0.05)。Western blot檢測細(xì)胞A375中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-582-5p過表達(dá)組N-cadherin、Vimentin表達(dá)量顯著低于miR-con組，E-cadherin蛋白水平明顯高于miR-con組(P<0.05)。見圖3，表3。

表3 miR-582-5p過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞A375遷移、侵襲的影響

圖3 miR-582-5p過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞A375遷移、侵襲的影響；A Transwell檢測人黑色素瘤細(xì)胞A375遷移和侵襲；B Western blot檢測N-cadherin、E-cadherin、Vimentin的表達(dá)

2.4 miR-582-5p靶向調(diào)控SOCS1的表達(dá) 生物信息學(xué)預(yù)測miR-582-5p的靶基因，結(jié)果顯示，SOCS1的3’UTR中部分核苷酸序列可與miR-582-5p 互補(bǔ)配對。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，與miR-con組比較，miR-582-5p明顯降低WT-SOCS1的熒光素酶相對活性(P<0.05)，但對MUT-SOCS1的熒光素酶相對活性無顯著影響。Western blot檢測SOCS1蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，miR-582-5p比miR-con組明顯減少SOCS1蛋白表達(dá)量(P<0.05)，anti-miR-582-5p較anti-miR-con組顯著提高SOCS1蛋白水平(P<0.05)。見圖4，表4、5。

圖4 miR-582-5p 靶向調(diào)控SOCS1的表達(dá);A SOCS1的3’UTR中含有與miR-582-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列；B Western blot檢測人黑色素瘤細(xì)胞 SOCS1蛋白表達(dá)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 過表達(dá)SOCS1逆轉(zhuǎn)了miR-582-5p 過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞A375增殖、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控作用與miR-con組比較，miR-582-5p過表達(dá)明顯降低A375細(xì)胞48 h、72 h的細(xì)胞活性、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、SOCS1、N-cadherin和Vimentin蛋白水平(P<0.05)，顯著增加細(xì)胞凋亡率、E-cadherin蛋白表達(dá)量(P<0.05)。同miR-582-5p +pcDNA組相比，miR-582-5p 和 pcDNA-SOCS1共轉(zhuǎn)染明顯提高A375細(xì)胞48h、72h的細(xì)胞活性、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、SOCS1、N-cadherin和Vimentin蛋白水平(P<0.05)，顯著減少細(xì)胞凋亡率、E-cadherin蛋白表達(dá)量(P<0.05)。見表6、7，圖5。

圖5 Western blot檢測人黑色素瘤細(xì)胞A375中SOCS1、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)

表5 miR-582-5p 調(diào)控SOCS1蛋白的表達(dá)

表6 過表達(dá)SOCS1逆轉(zhuǎn)了miR-582-5p 過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞A375增殖、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控作用

3 討論

在所有皮膚腫瘤中，黑色素瘤是最具侵襲性的一種，因?yàn)樗哂锌焖俎D(zhuǎn)移性、對傳統(tǒng)放射線和化療的耐藥性[15]。黑色素瘤也是皮膚癌死亡的主要原因，更全面地了解黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對于提高該病的診斷、預(yù)后和治療至關(guān)重要?？紤]到早期發(fā)現(xiàn)黑色素瘤的存活率更高，早期發(fā)現(xiàn)黑色素瘤的精確診斷測試將十分有利。此外，由于當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)，患者的存活率急劇下降，因此有必要改進(jìn)診斷工具，更精確地識別高?；颊卟㈩A(yù)測治療反應(yīng)。

表7 過表達(dá)SOCS1逆轉(zhuǎn)了miR-582-5p過表達(dá)對人黑色素瘤細(xì)胞中SOCS1、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響

miRNA是高度保守的短鏈RNA，由18到25個(gè)核苷酸組成[16]，具有廣泛的生物活性。miRNA通過與下游靶基因3’UTR的特定序列結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解和/或翻譯抑制，在許多細(xì)胞過程，如增殖、分化、細(xì)胞衰老、自噬和遷移等發(fā)揮重要作用[17]。已經(jīng)在各種類型的惡性腫瘤中鑒定出miRNA異常表達(dá)，包括黑色素瘤[18]。因此，研究黑色素瘤相關(guān)miRNA的作用和潛在的分子機(jī)制對于開發(fā)新的診斷生物標(biāo)志物和有效的治療靶標(biāo)是必不可少的。本實(shí)驗(yàn)檢測了miR-582-5p在黑色素瘤中的表達(dá)水平，確定miR-582-5p在黑色素瘤發(fā)展中的詳細(xì)作用。結(jié)果顯示，miR-582-5p在人黑色素瘤細(xì)胞株A375、G361、WM35、M14細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，這與其在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)臨床標(biāo)本和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)的結(jié)果一致[19]。同時(shí)，Wang等[19]的研究還發(fā)現(xiàn)，miR-582-5p過表達(dá)顯著抑制體外NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其發(fā)揮腫瘤抑制活性與靶向調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶激酶2(mitogen activated protein kinase kinase 2，MAP3K2)基因有關(guān)。Liu等[20]學(xué)者也觀察到miR-582-5p在NSCLC組織中的表達(dá)低于癌旁組織；miR-582-5p的異位表達(dá)顯著抑制NCI-H358細(xì)胞增殖和侵襲；miR-582-5p下調(diào)時(shí)則相反，細(xì)胞生長速度加快，PC-9細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。Zhang等[21]報(bào)道指出，miR-582-5p在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，在G0/G1期上調(diào)miR-582-5p可減少菌落數(shù)量，抑制細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞周期；當(dāng)miR-582-5p被抑制時(shí)，菌落數(shù)量增加，細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期得到促進(jìn)。本研究中，功能實(shí)驗(yàn)表明，miR-582-5p過表達(dá)明顯抑制黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與前述研究相符。

與胚胎發(fā)育相似，EMT的細(xì)胞表型變化也在致瘤過程中發(fā)揮作用[22]。EMT過程是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要現(xiàn)象，構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞表型特征的改變，使其具有更強(qiáng)的侵襲性[23]。Wang等[24]利用微陣列分析顯示，與匹配的鄰近正常組織相比，涎腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)樣本中miR-582-5p顯著下調(diào)；miR-582-5p表達(dá)通過靶向叉頭框C1(forkhead box C1，F(xiàn)OXC1)顯著影響細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力；隨著FOXC1的下調(diào)，E-cadherin升高，而Vimentin和snail蛋白降低，說明FOXC1可能通過使snail轉(zhuǎn)活來調(diào)控SACC細(xì)胞的EMT。本研究中，miR-582-5p過表達(dá)明顯降低A375細(xì)胞的N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)，顯著提高E-cadherin蛋白水平(P<0.05)，表明miR-582-5p對黑色素瘤細(xì)胞的EMT過程具有抑制作用。

幾種基因已被確定為miR-582-5p的直接靶標(biāo)，包括AKT3[9,10]、Rab27a[11]、MAP3K2[19]、缺口受體1(notch receptor 1，NOTCH1)[20]、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1，CDK1)[21]。本實(shí)驗(yàn)對miR-582-5p調(diào)節(jié)黑色素瘤發(fā)展的潛在分子機(jī)制展開進(jìn)一步研究。通過生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，證實(shí)SOCS1是黑色素瘤細(xì)胞中miR-582-5p的直接靶標(biāo)。SOCS1屬于SOCS家族，是癌癥發(fā)生的關(guān)鍵基因。先前報(bào)道，與正常卵巢組織相比，卵巢癌標(biāo)本中SOCS1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P=0.0215)[25]，與本研究結(jié)果一致。研究表明，SOCS1有利于黑色素瘤EMT，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，抑制抗腫瘤免疫；調(diào)控程序性細(xì)胞死亡1配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)表達(dá)可能解釋了這些作用；SOCS1的沉默導(dǎo)致B16F10-Nex2黑色素瘤細(xì)胞的致瘤表型部分逆轉(zhuǎn)，抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲[26]，提示靶向SOCS1可能是治療黑色素瘤患者一種有前景的方法。

總之，miR-582-5p在黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)，miR-582-5p過表達(dá)通過直接靶向SOCS1調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖、遷移、侵襲、凋亡和EMT，為黑色素瘤的治療提供了潛在的生物標(biāo)志物和有效靶點(diǎn)。