方侃，胡懷明，姜華軍，艾志兵，周圓

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部1、神經(jīng)內(nèi)科2，湖北 十堰 442000

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種起病隱匿、以認(rèn)知功能進行性衰減為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)退行性疾病，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。其發(fā)病機制尚不清楚，亦無特效的治療藥物。但可以肯定的是AD 最主要的危險因素是老齡化和衰老，而環(huán)境因素對AD 發(fā)生發(fā)展及患病后治療效果的影響越來越成為關(guān)注焦點。可吸入顆粒物(PM)[1-3]又稱懸浮粒子，指在氣體介質(zhì)中沉降速度可以忽略的小固體粒子、液體粒子及其懸浮體系。按其空氣動力學(xué)直徑PM 分為4 類：總懸浮顆粒物(≤100 μm，TSP)、粗顆粒物(≤10 μm，PM10)、細(xì)顆粒物(≤2.5 μm，PM2.5)、超細(xì)顆粒物(≤0.1 μm，UFPs)。國家《空氣質(zhì)量準(zhǔn)則》限定PM2.5年均值≤35 μg/m3、日均值≤75 μg/m3。當(dāng)PM2.5、UFPs進入人體過多時，不僅對呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等器官產(chǎn)生急性毒性作用，而且破壞血腦屏障(BBB)進入大腦，引發(fā)神經(jīng)損害和退行性病變。并且，這些顆粒物對老年人的易感性更強，在老年人體內(nèi)沉積率更高，更容易過度激活老年機體的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激系統(tǒng)[4-6]。少數(shù)研究提示，PM2.5和UFPs暴露與AD的發(fā)生有一定的相關(guān)性，且PM的生物學(xué)效應(yīng)受到其粒徑的影響[1-3，7]。為此，本研究模擬PM進入人體的正常途徑，探討不同粒徑PM 全身暴露對老年小鼠認(rèn)知功能的影響及其作用機制，為揭示AD 的發(fā)病機制和防治方法提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)檢測試劑盒(南京建成)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性檢測試劑盒(碧云天生物)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)、乙酰膽堿(ACh)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢博士德)；核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)ELISA 試劑盒(藍基生物)。DLPI-30 型低壓沖擊儀+顆粒物采樣器(芬蘭DEKATI)；HOPE-MED 8050 型動態(tài)氣溶膠染毒暴露系統(tǒng)(天津合普)；Nicomp 380 N3000 Basic 納米激光粒度儀(奧法美嘉)；MT-200 水迷宮行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟)。

1.2 實驗動物及其分組 健康昆明小鼠100 只，雄性，16 個月齡，體質(zhì)量50～55 g，SPF 級，購于湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心[SYXK(鄂)2016-0031]。在實驗前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，飼養(yǎng)環(huán)境：SPF 級，光暗交替(12 h/12 h)，室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度(50～60)%，自由飲食。按數(shù)表法將小鼠隨機分為正常對照組、生理鹽水組、PM10染毒組、PM2.5染毒組、UFPs染毒組，每組20 只。本實驗依照國家動物保護相關(guān)法規(guī)規(guī)定實施，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號：1811011)。

1.3 PM采樣及其染毒液的制備

1.3.1 PM采樣采樣地點 十堰市人民南路32號十堰市太和醫(yī)院感染性疾病治療中心樓頂；采樣點數(shù)量：1個；采樣高度：距離地面20 m；采樣時間：2018年12月25日至2019年6月25日。使用DLPI-30型低壓沖擊儀+顆粒物采樣器。此儀器可以對空氣中粒徑大小(16 nm～10 μm)不同的顆粒物進行分級(13 級)收集。該13 級切割粒徑(μm)與本實驗PM10、PM2.5、UFPs 的對應(yīng)關(guān)系厘定為，PM10：4.02、6.63、10.02；PM2.5：0.157、0.264、0.385、0.618、0.955、1.61、2.41；UFPs：0.028 5、0.056 3、0.094 6。

1.3.2 染毒液制備 采樣后，將濾膜剪成(1 cm×1 cm)左右的小塊，放入50 mL 的PVC 離心管中，加20 mL生理鹽水浸泡，超聲震蕩30 min，重復(fù)4次；用6層紗布過濾振蕩液，之后對濾液冷凍真空干燥，稱重后4℃冷藏備用。暴露時，用無菌生理鹽水將PM10、PM2.5、UFPs粉末分別配制成0 mg/mL、0.146 mg/mL、0.292 mg/mL、0.584 mg/mL 的懸液，并使用納米激光粒度儀檢測懸液顆粒物大小。染毒前超聲分散。

1.4 不同粒徑PM 全身暴露染毒 國家《空氣質(zhì)量準(zhǔn)則》限定PM2.5 日均值≤75 μg/m3。本實驗取其20 倍濃度為標(biāo)準(zhǔn)(1 500 μg/m3)，即小鼠每天平均吸入PM 1.46 mg/kg，采用動態(tài)氣溶膠染毒暴露系統(tǒng)對PM10、PM2.5、UFPs 染毒組小鼠實施全身暴露染毒。方法：將PM10、PM2.5、UFPs懸液按組分別加入標(biāo)準(zhǔn)配氣發(fā)生器，溫度恒定在(22±2)℃，使用PM質(zhì)量濃度實時監(jiān)測儀，動態(tài)監(jiān)測暴露艙內(nèi)的PM濃度，調(diào)節(jié)進氣/載氣的流量，控制艙內(nèi)PM濃度穩(wěn)定在(1 500±10)μg/m3，每天吸入12 h，連續(xù)4 周。生理鹽水組小鼠霧化吸入等劑量生理鹽水，正常對照組不做任何處理。

1.5 檢測指標(biāo)及其方法

1.5.1 Morris 水迷宮實驗 連續(xù)吸入染毒4 周后，行水迷宮訓(xùn)練和測試。①獲得性實驗：隨機從東/西/南/北4 個起始位置之一，將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠找到水下平臺的時間(s)，即潛伏期(IP)；若IP 超過60 s，以60 s 計，并引導(dǎo)小鼠至平臺，讓其在平臺上停留10 s。4 次/d，兩次間隔15 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。②探查實驗：在獲得性實驗結(jié)束的第2 天，將平臺移除，從原平臺對側(cè)象限將小鼠放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)進入原平臺象限的次數(shù)(ENT)及在該象限探查的時間(PT)。

1.5.2 標(biāo)本制備 行為學(xué)測試完畢，斷頭取腦，分離出大腦皮質(zhì)和海馬體，電子天平稱重，按10 mL/g添加冷生理鹽水，用玻璃勻漿器分別制成大腦勻漿；將勻漿液置于離心機(轉(zhuǎn)速10 000 r/min，4℃)中離心10 min，收集上清液，分裝于EP 管并分別標(biāo)記，置于-80℃冰箱冷凍待測。

1.5.3 大 腦 勻 漿TNF-α、IL-6、IL-1 β 含 量 及Caspase-3 活性檢測 從冰箱中取出一部分大腦勻漿上清液，平衡溫度后，按照各試劑盒(比色法)說明步驟進行操作；最后用分光光度計檢測各管吸光度，分別計算出TNF-α、IL-6、IL-1β含量及Caspase-3活性。

1.5.4 大腦勻漿SOD、GSH-Px活性、MDA和Ach含量與ChAT活性及NF-κB含量測定 從冰箱中取出另一部分大腦勻漿上清液，按各試劑盒(ELISA)說明，測定上清液中SOD、GSH-Px 活性、MDA 含量和Ach含量與ChAT 活性及NF-κ B 含量。酶標(biāo)儀型號：Multiskan MK3美國熱電全自動酶標(biāo)儀。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 雙盲錄入實驗數(shù)據(jù)，建立實驗結(jié)果數(shù)據(jù)庫；采用SPSS25.0 軟件進行統(tǒng)計分析；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()描述，五組間數(shù)據(jù)比較使用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 法；檢驗水準(zhǔn)均為α=0.05。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組小鼠Morris 水迷宮測試結(jié)果比較 與正常對照組比較，生理鹽水組、PM10 染毒組小鼠IP、ENT、PT 變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而PM2.5 染毒組IP 明顯延長、ENT 明顯減少、PT 明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與PM2.5 染毒組比較，UFPs 染毒組小鼠IP 明顯延長、ENT 明顯減少、PT明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 五組小鼠Morris水迷宮測試結(jié)果比較(

表1 五組小鼠Morris水迷宮測試結(jié)果比較(

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與PM2.5染毒組比較，bP＜0.05。

只數(shù)20 20 20 20 20 PT(s)26.58±2.09 25.96±2.92 24.87±3.72 22.48±2.63a 20.21±3.04b 3.824＜0.05組別正常對照組生理鹽水組PM10染毒組PM2.5染毒組UFPs染毒組F值P值IP(s)12.36±1.24 11.87±2.48 12.52±3.06 16.34±4.24a 19.82±3.48b 4.253＜0.05 ENT(次)5.37±0.43 5.50±0.84 5.19±0.77 4.26±1.38a 3.32±0.95b 3.437＜0.05

2.2 五組小鼠大腦勻漿TNF-α、IL-6、IL-1β及NF-κB 表達水平比較 與正常對照組比較，生理鹽水組、PM10 染毒組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB 表達水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而PM2.5 染毒組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB 表達水平明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與PM2.5染毒組比較，UFPs染毒組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB 表達水平亦明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與PM2.5染毒組比較，bP＜0.05。

2.3 五組小鼠大腦勻漿SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量比較 與正常對照組比較，生理鹽水組、PM10染毒組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而PM2.5染毒組小鼠SOD、GSH-Px活性明顯降低、MDA 含量明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜00.05)；與PM2.5 染毒組比較，UFPs 染毒組小鼠SOD、GSH-Px 活性明顯降低、MDA 含量明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 五組小鼠大腦勻漿SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較()

表3 五組小鼠大腦勻漿SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較()

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與PM2.5染毒組比較，bP＜0.05。

MDA(ng/mL)17.93±1.57 18.53±2.33 19.66±3.88 24.55±2.24a 32.26±3.65b 3.215＜0.05組別正常對照組生理鹽水組PM10染毒組PM2.5染毒組UFPs染毒組F值P 值只數(shù)20 20 20 20 20 SOD(IU/mL)2.23±0.19 2.17±0.23 2.11±0.26 1.68±0.54a 1.23±0.67b 3.078＜0.05 GSH-Px(IU/mL)37.87±2.86 38.45±3.17 36.72±4.25 28.56±2.71a 22.56±3.87b 3.679＜0.05

2.4 五組小鼠大腦勻漿Ach含量與ChAT活性及Caspase-3 活性比較 與正常對照組比較，生理鹽水組、PM10 染毒組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織Ach 含量與ChAT活性及Caspase-3活性變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而PM2.5 染毒組小鼠Ach 含量和ChAT活性明顯降低，Caspase-3活性明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與PM2.5染毒組比較，UFPs染毒組小鼠Ach含量和ChAT活性明顯降低，Caspase-3活性明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 五組小鼠大腦勻漿Ach 含量與ChAT 活性及Caspase-3 活性比較()

表4 五組小鼠大腦勻漿Ach 含量與ChAT 活性及Caspase-3 活性比較()

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與PM2.5染毒組比較，bP＜0.05。

Caspase-3(kU/g)357.54±22.65 355.63±27.19 360.54±30.53 412.67±33.29a 461.51±23.68b 3.348＜0.05組別正常對照組生理鹽水組PM10染毒組PM2.5染毒組UFPs染毒組F值P值只數(shù)20 20 20 20 20 Ach(μg/mL)204.29±13.53 205.13±15.26 201.95±18.52 183.96±10.64a 170.58±14.23b 4.025＜0.05 ChAT(U/g)90.13±7.25 89.64±6.49 88.24±5.43 64.77±4.33a 52.07±3.62b 3.549＜0.05

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，PM2.5、UFPs染毒組IP明顯延長、ENT明顯減少、PT明顯縮短，即PM2.5、UFPs全身暴露可以導(dǎo)致老年小鼠認(rèn)知功能障礙，以后者為甚。這與王昊等[1]、孔玲等[8]、AILSHIRE等[9]綜述分析結(jié)果一致。劉旭東[2]、卞晶晶[10]研究表明，隨著PM2.5 染毒濃度的提高，大鼠出現(xiàn)認(rèn)知能力下降并逐漸加重。王蛟男[11]、AARóN 等[12]流行病學(xué)調(diào)查亦證實，環(huán)境PM2.5 暴露與老年人認(rèn)知功能障礙高度關(guān)聯(lián)。

與正常對照組比較，PM2.5、UFPs 染毒組大腦皮質(zhì)和海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB 等炎癥反應(yīng)指標(biāo)的表達水平明顯提高；與李春艷[13]研究結(jié)果一致。蘇瑞軍等[14]研究，從鼻滴入20 μL 6 mg/mL PM2.5溶液，1 次/2 d，連續(xù)30 d，可減輕小鼠腦重量，上調(diào)腦炎癥因子的表達。馮德達[15]研究中經(jīng)氣管滴注PM細(xì)顆粒物(37.5 mg/kg)染毒，隔天1次，共3次，大鼠大腦皮質(zhì)、海馬TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB表達水平明顯提高。

與正常對照組比較，PM2.5、UFPs染毒組大腦皮質(zhì)和海馬組織SOD、GSH-Px活性明顯降低、MDA含量明顯提高。張克婷等[16]研究中，PM1.0染毒7 d后，誘發(fā)大鼠腦皮層氧化應(yīng)激反應(yīng)，SOD、GSH-Px表達明顯下調(diào)、MDA表達明顯上調(diào)，支持本研究結(jié)果。張海涯[17]研究中，妊娠期和哺乳期PM2.5 暴露，6 h/d，大鼠出生60 d后海馬組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量明顯變化及學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。

與正常對照組比較，PM2.5、UFPs染毒組大腦皮質(zhì)和海馬組織Ach含量、ChAT活性明顯降低、Caspase-3活性明顯提高；與CHENG等[18]研究結(jié)果一致。劉旭東[3]研究表明，尾靜脈分別注射6.25 mg/(kg·d)、12.5 mg/(kg·d)單壁碳納米管后，細(xì)胞凋亡因子Caspase-3 活性明顯提高。ChAT功能是將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到膽堿上形成Ach；Ach 是大腦內(nèi)的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，參與認(rèn)知、記憶及注意力等過程。腦組織的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，直接損傷神經(jīng)元，或Caspase-3活化引發(fā)神經(jīng)元凋亡，均可導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)損傷及Ach 含量、ChAT 活性降低[19]，從而引起小鼠認(rèn)知功能障礙。

本研究結(jié)果進一步顯示，PM10、PM2.5、UFPs 對老年小鼠同等濃度、同等劑量、同等時間暴露后，對小鼠行為學(xué)、大腦炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、膽堿能神經(jīng)損傷及細(xì)胞凋亡等各項指標(biāo)的影響呈現(xiàn)明顯差異，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；即PM10、PM2.5、UFPs的生物學(xué)效應(yīng)不同，UFPs最強，PM2.5次之，PM10最弱；人體吸氣時，PM 隨空氣進入呼吸系統(tǒng)，PM 粒徑越小就越容易進入深部，沉積率也越高，損傷也就越嚴(yán)重。

本實驗小鼠吸入PM10 (2.5 μm＜PM10≤10 μm)后，其大腦損傷不明顯，認(rèn)知功能亦無明顯下降?？赡艿脑蚴?，PM10可進入并沉積在鼻、咽、喉及氣管，尤其在氣管，隨著分泌物移動、纖毛擺動及咳嗽反射，沉積的PM10 可排出體外。PM2.5 (0.1 μm＜PM2.5≤2.5 μm)可到達終末細(xì)支氣管和肺泡，大部分沉積在肺內(nèi)，主要損傷該器官。有研究報道，PM2.5與特定蛋白(ApoE、轉(zhuǎn)鐵蛋白)結(jié)合，可以穿過完整的BBB 進入大腦，激活小膠質(zhì)細(xì)胞或抑制抗氧化物質(zhì)，引發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，損傷大腦[20-21]。另外，PM2.5 通常富集Al、Pb、Ni、Mn等成分，具有明顯的神經(jīng)毒性。

然而，UFPs(≤0.1 μm)的粒徑尺度已經(jīng)達到納米級，其理化性質(zhì)發(fā)生了很大的變化，顯示出強烈的表面效應(yīng)、尺寸效應(yīng)、體積效應(yīng)及隧道效應(yīng)，從而呈現(xiàn)不同的特性。因此，一方面，UFPs 可以穿透呼吸膜或氣血屏障，并隨血液循環(huán)到腦部，直接跨過BBB 進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；另一方面，UFPs 可以通過嗅球途徑進入大腦。研究發(fā)現(xiàn)，嗅覺信息可以通過內(nèi)嗅皮層輸入到海馬，即嗅覺信息→嗅覺受體→嗅球→初級嗅皮質(zhì)(前嗅核、嗅結(jié)節(jié)、梨狀皮質(zhì))→內(nèi)嗅皮層→穿通纖維→海馬，從而有效激發(fā)海馬神經(jīng)元[1，22-24]。而UFPs 也可以避開BBB經(jīng)過這一途徑輸送到海馬，再通過海馬進入大腦。如鎘、銀、氧化鐵、氧化錳、二氧化鈦等金屬顆粒物及元素碳顆粒，可通過這一途徑在大腦蓄積。在輸送UFPs的過程中，沿路神經(jīng)元和神經(jīng)纖維受損，突觸丟失，引發(fā)嗅覺功能障礙；而嗅覺功能障礙可進一步影響嗅覺信息到海馬的傳遞，使內(nèi)嗅皮層和海馬發(fā)生萎縮，進而導(dǎo)致記憶力下降。

綜上所述，UFPs通過血腦屏障和嗅覺神經(jīng)傳導(dǎo)兩個途徑大量進入大腦，誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，引起大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元廣泛損傷和認(rèn)知功能明顯障礙；而PM2.5只通過穿透BBB一條途徑進入大腦，且此途徑通過量低于UFPs；故UFPs的神經(jīng)毒性和生物學(xué)效應(yīng)比PM2.5更強。