劉宗華 綜述，薛巍 審校

暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，廣東 廣州 510632

肺炎球菌是人類最常見的細(xì)菌性病原微生物之一，是引起肺炎、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎和菌血癥等的主要病原體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約119萬人死于肺炎球菌感染，其中，主要為5歲以下兒童，且90%以上病例發(fā)生在發(fā)展中國家和欠發(fā)達(dá)國家［1-2］。兒童肺炎球菌感染已成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前，肺炎球菌感染的臨床治療措施主要為抗生素治療，但抗生素的廣泛應(yīng)用使肺炎球菌的耐藥性問題日益嚴(yán)重。

針對肺炎球菌的感染和傳播，優(yōu)選方案是采用肺炎球菌疫苗進(jìn)行提前預(yù)防。目前已上市的兩種肺炎球菌疫苗是基于肺炎球菌莢膜多糖所開發(fā)的23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗（23-valent pneumococcus polysaccharide vaccine，PPV23）和13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗（13-valent pneumococcus conjugate vaccine，PCV13）［3］。在歐美等發(fā)達(dá)國家，這兩種疫苗的廣泛使用在很大程度上降低了肺炎球菌感染疾病的發(fā)生，取得了良好的疾病預(yù)防效果。但這兩種疫苗仍存在制備成本高、血清型覆蓋率有限等局限性。此外，PPV23缺乏對2歲以下嬰幼兒的免疫原性［4］。PCV13克服了PPV23的許多局限性，但不能預(yù)防所有血清型的肺炎球菌感染，且存在“血清型替代”問題，即非疫苗血清型的擴(kuò)張，這是由于從接種人群中剔除了與之競爭的疫苗血清型，而使其能夠定植宿主［5］。

為了克服上述傳統(tǒng)多糖疫苗的局限性，急需開發(fā)廣譜的新型肺炎球菌疫苗，以對更廣泛的肺炎球菌菌株提供更經(jīng)濟(jì)的保護(hù)［6］。目前，新型肺炎球菌疫苗的開發(fā)主要聚焦于蛋白疫苗、全細(xì)胞疫苗、DNA疫苗等［7］。由于在不同血清型菌株間高度的保守性，蛋白抗原成為新型肺炎球菌疫苗開發(fā)的重要突破口［8］。其中，已處于研究階段的肺炎球菌蛋白疫苗的候選抗原蛋白包括溶血素、肺炎球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A，PspA）和 PspC、肺炎球菌表面黏附素A（pneumococcal surface adhesion A，PsaA）、依賴于ATP的酪蛋白溶解蛋白酶（ATP-dependent caseinolytic protease，ClpP）、假定脂肪酸蛋白連接酶（putative lipoate-protein ligase，Lpl）、膽堿結(jié)合蛋白 A（choline binding protein A，CbpA）等［9］。研究表明，所有肺炎球菌血清型均含這些候選抗原蛋白，可提供對肺炎球菌的有力保護(hù)［10］。本文對以溶血素為抗原蛋白的新型肺炎球菌疫苗的研究進(jìn)展作一綜述。

1 肺炎球菌溶血素的結(jié)構(gòu)及生物活性

溶血素是肺炎球菌主要的蛋白質(zhì)毒力因子［11-12］，屬于結(jié)合膽固醇并在細(xì)胞膜上打孔的細(xì)菌毒素家族［13-15］。目前已知的97種肺炎球菌血清型幾乎均產(chǎn)生溶血素［16］。溶血素分子含471個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為53 000，含4個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域［17-18］：結(jié)構(gòu)域1、2、3維持溶血素分子的穩(wěn)定性；而結(jié)構(gòu)域4（包括氨基酸殘基序列360-469）為該蛋白的C-末端序列，促進(jìn)對靶細(xì)胞膜上膽固醇的結(jié)合，再在靶細(xì)胞膜疏水結(jié)合區(qū)域形成孔結(jié)構(gòu)。多個(gè)毒素單體聚集起來，組裝成圓形的前孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)過一系列構(gòu)象轉(zhuǎn)變，形成β-圓桶型的穿膜孔，直徑為35 nm，每個(gè)孔含50個(gè)溶血素單體分子［19］。溶血素的靶向治療是增強(qiáng)肺炎球菌相關(guān)疾病療效的有利策略［20］。其中以溶血素為蛋白抗原開發(fā)的新型肺炎球菌疫苗［21］，能夠克服傳統(tǒng)多糖疫苗“血清型替代”的局限性，有廣泛的肺炎球菌血清型覆蓋率，具有極為重要的臨床應(yīng)用價(jià)值以及重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

作為一種候選抗原，溶血素會(huì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上打孔而導(dǎo)致細(xì)胞壞死，其具有很大的細(xì)胞毒性，在很大程度上限制了其作為蛋白抗原的肺炎球菌疫苗的開發(fā)。理想的疫苗候選抗原應(yīng)具備特異性、保守性、低毒性、能夠定位于病原表面等特征。30年前，溶血素即已被考慮作為疫苗抗原，但由于其固有的細(xì)胞溶解活性，無法直接使用天然的溶血素蛋白作為候選抗原，這成為該研究領(lǐng)域長期存在的關(guān)鍵問題。適當(dāng)解毒并保持免疫原性的溶血素是理想的疫苗候選抗原。鑒于此，開發(fā)肺炎球菌溶血素疫苗所面臨的首要問題是必須解決溶血素的細(xì)胞膜裂解毒性。

2 溶血素的解毒

為了解決溶血素對細(xì)胞膜打孔的毒性問題，研究者采取了各種各樣的減毒措施，在不同程度上降低了溶血素的毒性，推動(dòng)了基于溶血素為抗原的新型肺炎球菌疫苗的開發(fā)。

2.1 溶血素的生物學(xué)解毒方法 為了降低溶血素的細(xì)胞裂解活性，研究者對其關(guān)鍵基因序列進(jìn)行了各種基因工程修飾，見表1。早在1991年，澳大利亞的PATON研究組報(bào)道了一個(gè)廣泛研究的溶血素突變體，通常稱為PdB類毒素，在433位有色氨酸-苯丙氨酸取代（Trp433Phe）［22］。雖然 PdB 突變體是一個(gè)有希望的疫苗候選抗原，但其具有低水平的溶血活性。該突變體在宿主細(xì)胞膜中形成大孔，與野生型溶血素相比，其溶血活性保留了0.1%～1%。后來，該研究組又報(bào)道了幾種溶血素突變體：His367Arg、Trp433Phe Cys428Gly、Trp433Phe Cys428Gly Asp385-Asn，其細(xì)胞毒性分別為野生型溶血素的0.02%、0.000 1%和 0.000 1%［23］。

表1 溶血素的基因突變體Tab.1 Mutants of pneumolysin

英國格拉斯哥大學(xué)的KIRKHAM等［24］通過在具有寡聚功能的區(qū)域進(jìn)行突變，構(gòu)建了一系列溶血素突變體，從中篩選出兩種解毒溶血素突變體：一個(gè)是單一氨基酸缺失的溶血素突變體△A146 Ply，該突變體不能在細(xì)胞膜中打孔或刺激可由天然溶血素處理引起的體內(nèi)炎癥效應(yīng)，非常適合作為蛋白抗原；另一個(gè)是△6Ply，在參與寡聚的區(qū)域有一個(gè)雙氨基酸缺失（A146R147），與其他溶血素突變體不同，其顯示出良好的免疫原性而無打孔活性，且在體外不會(huì)誘導(dǎo)與人中性粒細(xì)胞的組織損傷相關(guān)的促炎活性［25］。

賽諾菲巴斯德制藥公司報(bào)道了一個(gè)高度解毒的溶血素突變體PlyD1［26］，其顯著優(yōu)點(diǎn)是具有雙重解毒機(jī)制。為構(gòu)建PlyD1而設(shè)計(jì)的兩個(gè)關(guān)鍵突變是T65C和G293C，僅突變G293C可消除溶血素的溶血活性。此外，T65C和G293C的聯(lián)合突變，可在溶血素的1域與3域之間引入一個(gè)二硫鍵，以防止溶血素從前孔向成孔構(gòu)象轉(zhuǎn)變。從疫苗安全性角度來看，這種內(nèi)在的解毒機(jī)制雙保險(xiǎn)非?？扇?。該公司還報(bào)道了一種系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)法（systematic structuredriven approach），使用3種構(gòu)象限制技術(shù)，合理地設(shè)計(jì)了缺乏溶血活性但仍能誘導(dǎo)針對野生型毒素的中和抗體的溶血素衍生物［27］。

吉林大學(xué)的SUN等［28］通過替換兩種氨基酸（C428G和W433F）開發(fā)了一種高度脫毒的溶血素突變體PlyM2，其失去了細(xì)胞毒性，但保留了誘導(dǎo)中和抗體的能力。

2.2 溶血素的其他解毒方法 溶血素解毒除了主要采用上述基因工程方法之外，還有一些化學(xué)和物理方法。瑞典的葛蘭素史克疫苗公司報(bào)道采用優(yōu)化的甲醛處理方法制備了一個(gè)完全解毒且解毒不可逆的溶血素，并有望大規(guī)模生產(chǎn)［29］。用該解毒溶血素處理實(shí)驗(yàn)鼠，并通過注射部位的組織學(xué)分析證實(shí)了解毒效果。用該解毒溶血素免疫接種，誘導(dǎo)了溶血素特異性功能抗體，能夠在溶血實(shí)驗(yàn)中抑制溶血素活性。此外，用該解毒溶血素免疫小鼠，可抵抗溶血素的致命鼻內(nèi)攻擊，且鼻腔免疫接種可抑制同源或異源性肺炎球菌菌株的鼻咽定植［29］。上述研究表明，該解毒溶血素作為一種有效的候選抗原可用于進(jìn)一步開發(fā)肺炎球菌疫苗。

在前期研究中我們嘗試采用納米技術(shù)來解決溶血素的毒性問題。對溶血素采用簡單的熱處理（70℃）和Fe3+復(fù)合的簡易物理方法，制備減毒溶血素納米顆粒疫苗制劑。該方法能有效降低溶血素的毒性，但在免疫接種實(shí)驗(yàn)中未能誘導(dǎo)有效的抗體。推測其原因在于：熱處理會(huì)改變?nèi)苎乜乖臉?gòu)象，從而破壞一些抗原決定簇的空間結(jié)構(gòu)。

3 溶血素的佐劑／遞送系統(tǒng)

作為亞單位疫苗，純化的可溶性溶血素本身免疫原性較差，還需為其匹配合適的疫苗佐劑，用于輔助該抗原，誘導(dǎo)安全、有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答［30］。隨著對疫苗佐劑研究的不斷深入，依據(jù)其作用機(jī)理，可將疫苗佐劑分為免疫刺激分子和抗原遞送系統(tǒng)。前者主要通過直接刺激免疫系統(tǒng)而輔助抗原引發(fā)更高強(qiáng)度的免疫應(yīng)答，后者主要通過有效的攜帶和遞送抗原而促進(jìn)抗原的免疫應(yīng)答。

3.1 與溶血素配伍的傳統(tǒng)佐劑 在新型肺炎球菌溶血素疫苗的開發(fā)過程中，針對解毒的溶血素抗原，主要是直接使用傳統(tǒng)的佐劑與之配伍，制備成疫苗制劑，如解毒的溶血素突變體 PdB［31］、ΔA146 Ply［24］、PlyD1［32］等均使用了鋁佐劑［33］。也有報(bào)道以單磷酸脂（monophospholipid，MPL）A 為佐劑，用于溶血素類毒素衍生物（a genetic toxoid derivative of pneumolysin，W433F，PdB）的免疫接種攻毒實(shí)驗(yàn)［31］。

賽諾菲巴斯德制藥公司研究了由肺炎球菌組氨酸三聯(lián)體蛋白D（pneumococcal histidine triad protein D，PhtD）、肺炎球菌膽堿結(jié)合蛋白A（pneumococcal choline binding protein A，PcpA）和解毒溶血素突變體PlyD1 3種抗原組成的實(shí)驗(yàn)性肺炎球菌疫苗的免疫原性、穩(wěn)定性和吸附特性，結(jié)果表明，采用氫氧化鋁佐劑的每個(gè)抗原的抗體反應(yīng)均顯著高于用磷酸鋁佐劑或無佐劑的抗原。較低的微環(huán)境pH值和較低的抗原吸附強(qiáng)度顯著提高了抗原的穩(wěn)定性。抗原的穩(wěn)定性與其在小鼠體內(nèi)的免疫原性密切相關(guān)，表明用磷酸根離子預(yù)處理氫氧化鋁佐劑可提高其穩(wěn)定性。該研究發(fā)現(xiàn)，鋁鹽佐劑的類型（氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑）、吸附強(qiáng)度和微環(huán)境pH值對該疫苗的免疫原性和化學(xué)穩(wěn)定性有顯著影響［34］。

3.2 溶血素的新型遞送系統(tǒng) 與免疫刺激分子的佐劑原理不同，抗原載體／遞送系統(tǒng)能在抗原的負(fù)載、緩控釋、靶向抗原遞呈細(xì)胞、抗原攝入、抗原遞呈方式等各方面促進(jìn)對抗原的有效遞送，在誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。吉林大學(xué)的LU等［35］首先開發(fā)了一種高度脫毒的溶血素突變體Plym2，再以細(xì)菌樣顆粒（bacteria like particles，BLPs）為載體和免疫增強(qiáng)劑，將Plym2蛋白展示在該顆粒表面，研制成Plym2鼻黏膜接種疫苗。巴西的GOULART等［36］采用重組卡介苗（BCG）菌株（一種已知佐劑特性的結(jié)核病預(yù)防性疫苗）來表達(dá)并遞送PspA-PdT融合蛋白，制成新型肺炎球菌疫苗。

古巴的 GONZáLEZ-MIRó 等［37］在聚羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）珠上分別展示肺炎球菌血清型19F的溶血素和莢膜多糖，以增強(qiáng)免疫原性，評價(jià)了PHB珠作為蛋白抗原溶血素和莢膜多糖載體的潛力，檢測了疫苗接種后的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，用于預(yù)防肺炎球菌感染。為了在PHB珠表面展示溶血素，將溶血素與PHB合酶（PhaC）的N-端融合，該酶介導(dǎo)重組大腸埃希菌中PHB珠的組裝，展示溶血素的PHB珠作為抗原遞送系統(tǒng)。該研究組還采用化學(xué)方法將莢膜多糖19F偶聯(lián)至分離的PHB珠上，以進(jìn)一步評估其抗原載體特性。

重慶醫(yī)科大學(xué)的WU等［38］將幾種主要的磷酸鈣生物礦化肽融合至溶血素解毒突變體ΔA146PLY的C-端，從而使生物相容性的磷酸鈣可與該蛋白一起礦化，以制備生物礦化的溶血素納米顆粒。他們制備了4種不同的納米粒子，并闡明了磷酸鈣結(jié)合域?qū){米粒子大小、形狀及表面鈣含量的影響，并研究了其免疫保護(hù)作用，以篩選出體外和體內(nèi)最有效的制劑。

4 展望

以溶血素為抗原的新型肺炎球菌疫苗的開發(fā)，需從溶血素的解毒及其佐劑／遞送系統(tǒng)的選擇兩方面開展。在溶血素的解毒方面，除了現(xiàn)有的基因工程方法之外，還需進(jìn)一步嘗試一些簡單、易行、有效的物理或化學(xué)方法，以便大規(guī)模生產(chǎn)；在溶血素的佐劑／遞送系統(tǒng)的選擇方面，仍需進(jìn)一步嘗試更多的新型佐劑或抗原遞送系統(tǒng)，以輔助溶血素引發(fā)高效安全的免疫應(yīng)答保護(hù)。