谷長(zhǎng)維，胡博

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112

A 組輪狀病毒（group A rotavirus，RVA）為呼腸孤病毒科家族成員之一，是世界嬰幼兒胃腸炎的主要誘因。2016年，RVA導(dǎo)致全球128 500名5歲以下兒童死亡，給許多國(guó)家?guī)?lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。輪狀病毒疫苗其防控效果明顯［2-4］，但疫苗的選擇壓力可能會(huì)造成流行毒株的改變。RVA基因組有11個(gè)雙鏈RNA基因片段，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4、VP6、VP7）及 6 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1 ～ NSP6）［5］。半巢式多重PCR技術(shù)是目前常用的RVA基因分型方法，特別是GOUVER等［6］報(bào)道的VP7引物仍在世界范圍內(nèi)使用。2015—2017年全國(guó)流行病學(xué)傳染病監(jiān)測(cè)（The National Epidemiological Surveillance of Infectious Disease，NESID）數(shù)據(jù)顯示，RVA的VP7基因型的鑒定方法約50%是基于測(cè)序，其余是基于多重PCR。

本研究根據(jù)GenBank上登錄的RVA VP7基因5′端保守區(qū)，設(shè)計(jì)一系列VP7特異性引物，建立半巢式多重PCR檢測(cè)方法，以期為輪狀病毒感染的監(jiān)測(cè)、診斷及治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 毒株 RVA 毒株 SP15-09（Wa-like G1P［8］）、NT036（Wa-like G1P［8］）、SP15-06（DS-1-like G1P［8］）、To16-04（G2P［4］），KN105（Wa-like G3）、To16-01（equine-like，DS-1-likeG3）、OH279（G4P［8］）、TA15-07（G8P［8］）、To14-25（G9 lineage3）、To16-02（G9 lineage 6）及NS17-5（G12）均由日本北里生命研究所惠贈(zèng)（已測(cè)序，基因分型已確定）。

1.2 主要試劑 Premix Ex TaqTMHot Start Version購(gòu)自日本TaKaRa公司；無(wú)DNase／RNase水購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 半巢式多重PCR法對(duì)VP7基因分型 根據(jù)Gen-Bank中RVA VP7基因5′端保守區(qū)設(shè)計(jì)合成多組基因分型引物，引物序列見(jiàn)表1。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。采用RNA提取試劑盒分別提取11個(gè)RVA株病毒RNA，進(jìn)行RT-PCR（第1輪PCR）。反應(yīng)前，RNA樣品和第1輪PCR引物對(duì)于65℃孵育5 min。第1輪PCR反應(yīng)條件：50℃ 30 min，94℃2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。第1輪PCR產(chǎn)物用無(wú)DNase／RNase水稀釋50倍，取2 μL稀釋液作為多重PCR（第2輪PCR）樣品，第2輪PCR使用第2輪PCR引物在Premix Ex TaqTMHot Start Version試劑上進(jìn)行。第2輪PCR反應(yīng)條件：94℃ 30 s；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃60 s，共20個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 VP7基因分型引物序列Tab 1.Primer sequences used for VP7 genotyping

1.4 序列比對(duì) 從GenBank上檢索具有代表性的RVA株VP7核苷酸序列，使用BLAST在線軟件進(jìn)行序列比對(duì)，評(píng)價(jià)引物特異性。

2 結(jié)果

2.1 第1輪PCR產(chǎn)物鑒定 11個(gè)RVA毒株的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見(jiàn)大小為902 bp的目的基因條帶，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。

圖1 11個(gè)RVA毒株第1輪PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Products of the first cycle of PCR for 11 RVA virus strains

2.2 第2輪PCR產(chǎn)物鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，11個(gè)RVA毒株的目的基因條帶大小均與預(yù)期一致，見(jiàn)圖2。表明按設(shè)計(jì)的RVA VP7基因型各引物可通過(guò)半巢式多重PCR方法鑒別RVA基因型。

圖2 11個(gè)RVA毒株第2輪PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Products of the second cycle of PCR for 11 RVA virus strains

2.3 序列比對(duì)結(jié)果 經(jīng)BLAST在線軟件比對(duì)，RVA株VP7基因序列與設(shè)計(jì)的上游引物匹配，并與下游引物互補(bǔ)，表明設(shè)計(jì)的引物特異性良好。

3 討論

多年來(lái)VP7引物序列更新緩慢，一些毒株通過(guò)該引物對(duì)被錯(cuò)誤鑒定［7］，ITURRIZA-GOMARA 等［8］雖改進(jìn)了一些引物序列，但仍存在基因型判斷錯(cuò)誤的問(wèn)題未得到解決，如To16-01（equine-like，DS-1-likeG3）和G12菌株不能通過(guò)其引物對(duì)鑒定。以ESONA等［9］報(bào)道的新引物集為RVA VP7基因分型，但To16-01（equine-like，DS-1-likeG3）和 G8 菌株不能通過(guò)該引物集確定。羅小芳等［10］設(shè)計(jì)的RVA VP7基因引物序列僅對(duì)G1、G2、G3、G9基因型進(jìn)行分型，對(duì)新流行的毒株型別無(wú)法鑒別。

本研究根據(jù)最近RVA流行毒株，設(shè)計(jì)多組分型引物，應(yīng)用半巢式多重PCR對(duì)11個(gè)RVA VP7基因進(jìn)行正確精準(zhǔn)分型。采用G3-809F及G3e-757F引物檢測(cè)，能通過(guò)條帶大小區(qū)別KN105（Wa-like G3）株和 To16-01（equine-like，DS-1-likeG3）株。本文設(shè)計(jì)的引物能正確鑒別大多數(shù)RVA流行毒株VP7基因型，包括新出現(xiàn)的毒株［如To16-01（equine-like，DS-1-likeG3），G8及G12］。但RVA有許多種基因型，且跨物種傳播，有時(shí)還發(fā)生基因重組［11］。因此，引物序列需通過(guò)與流行毒株序列進(jìn)行比對(duì)核實(shí)并加以改進(jìn)。

序列分析對(duì)于正確基因分型非常重要。而基因型分布可根據(jù)地區(qū)及季節(jié)的不同而變化，對(duì)于詳細(xì)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，建議各地區(qū)的疾病監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)改變傳統(tǒng)的工作方式，可通過(guò)半巢式多重PCR方法分析RVA基因型。

本研究應(yīng)用設(shè)計(jì)的RVA VP7基因型引物集建立的多重PCR方法，為輪狀病毒感染的監(jiān)測(cè)、診斷及治療提供了技術(shù)支持。