戴興德，鄭小芳，火文琴，張小林

甘肅醫(yī)學院藥學系，甘肅 平?jīng)?744000

青霉素殘留是乳制品行業(yè)一個重要監(jiān)控指標［1-2］，為逃避打擊，一些不法商販在牛乳中添加抗生素分解劑（β-內(nèi)酰胺酶）以分解牛乳中殘留青霉素。β-內(nèi)酰胺酶又稱青霉素酶，可水解青霉素類物質(zhì)而使其失效［3］，常用于青霉素藥品的無菌試驗［4］。β-內(nèi)酰胺酶會造成β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性，危害消費者身體健康［5］，因此，實施牛奶中β-內(nèi)酰胺酶定量十分必要。目前，β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法有碘量法［6-8］、pH 法［9-10］、微生物法［11-16］、高效液相色譜法［17］、紫外光度法［18］等，這些方法過程復雜，大多以定性為主，檢出限偏高。

青霉素分子中的硫原子可將Fe3+還原為Fe2+（青霉素水解產(chǎn)物青霉噻唑酸與Fe3+不反應），F(xiàn)e2+與［Fe（CN）6］3-反應生成可溶性普魯士藍 KFeⅢ［FeⅡ（CN）6］，β-內(nèi)酰胺酶阻止該顯色反應，吸光度值（A）下降，可根據(jù)ΔA計算β-內(nèi)酰胺酶的濃度。本研究根據(jù)該原理建立牛奶制品中β-內(nèi)酰胺酶殘留量的普魯士藍顯色光度法，并進行優(yōu)化及驗證。

1 材料與方法

1.1 樣品 脫脂奶粉及鮮牛奶均為市售產(chǎn)品。

1.2 主要試劑 β-內(nèi)酰胺酶凍干粉（批號：B1728048，標示量為10 MU）購自上海一研生物科技有限公司；青霉素鈉（標示量：400萬單位，總質(zhì)量：2.4 g）購自哈藥集團有限公司；硫酸鐵銨（分析純）及硫氰酸鉀（分析純）購自天津市瑞金特化學品有限公司。

1.3 溶液的制備 β-內(nèi)酰胺酶儲備溶液：將β-內(nèi)酰胺酶凍干粉用1 000 mL的PBS溶解，采用碘量法［6］標定；β-內(nèi)酰胺酶標準溶液：臨用前將儲備溶液稀釋為200 U／mL；800 U／mL青霉素溶液：稱取0.12 g青霉素鈉，用pH 7.0的PBS溶解，定容至250 mL（1 mg青霉素鈉效價為 1 667 U）；0.01 mol／L Fe3+硫酸溶液：精確稱取2.66 g硫酸鐵銨，用20 mL硫酸（1mol／L）溶解，定容至 1000mL；0.1mol／L［Fe（CN）6］3-溶液：取硫氰酸鉀9.7 g，蒸餾水溶解，定容至1 000 mL；醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.5）：取醋酸鈉 18 g，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀釋至1 000 mL；實驗用水均為蒸餾水。

1.4 方法的建立 將5 mL的800 U／mL青霉素溶液與β-內(nèi)酰胺酶標準溶液混合，于37℃水??；加入0.01 mol／L Fe3+硫酸溶液，水?。凰鳑_洗冷卻，依次加入5 mL的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.5）和0.1 mol／L［Fe（CN）6］3-，蒸餾水定容至 50 mL，用1 cm比色皿，以蒸餾水作參比，經(jīng)分光光度計測定吸光度值（A）。

1.5 方法的優(yōu)化

1.5.1 吸收波長的確定 將青霉素溶液與4.00 mL β-內(nèi)酰胺酶標準溶液混合，37℃水浴15 min，加入Fe3+硫酸溶液 5 mL，100 ℃水浴 20 min，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 5 mL，［Fe（CN）6］3-溶液 1 mL，在波長500～900 nm范圍內(nèi)測定A，以檢測波長為橫坐標，A為縱坐標，繪制催化體系吸收光譜曲線。同時建立空白體系（不加青霉素和β-內(nèi)酰胺酶）及非催化體系（不加β-內(nèi)酰胺酶）。

1.5.2 Fe3+硫酸溶液體積的確定 將青霉素溶液與不同體積的 Fe3+硫酸溶液（0、1、2、3、4、5、6 mL）混合，100℃水浴20 min；水流沖洗冷卻，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 5 mL，［Fe（CN）6］3-溶液 1 mL，在波長680 nm處測定A。

1.5.3 ［Fe（CN）6］3-體積的確定 將青霉素溶液與5 mL Fe3+硫酸溶液混合，100℃水浴20 min；水流沖洗冷卻，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液5 mL及不同體積的［Fe（CN）6］3-溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mL），在波長680 nm處測定A。

1.5.4 顯色反應溫度及時間的確定 將青霉素溶液與5 mL Fe3+硫酸溶液混合，分別于不同溫度（50、70、100 ℃）水浴不同時間（0～60 min）；水流沖洗冷卻，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 5 mL，［Fe（CN）6］3-溶液1 mL，在波長680 nm處測定A。

1.5.5 顯色反應pH的確定 將青霉素溶液與5 mL Fe3+硫酸溶液混合，用0.1 mol／L氫氧化鈉和0.1 mol／L鹽酸將混合液pH分別調(diào)節(jié)為0.3～9.0，100 ℃水浴 20 min；水流沖洗冷卻，加入［Fe（CN）6］3-溶液1 mL，在波長680 nm處測定A。

1.5.6 酶促反應時間的確定 將青霉素溶液與4.00 mL β-內(nèi)酰胺酶標準溶液混合，于37℃水浴不同時間（1、2、3、4、5、7、9、11、13、15、17 min），加入 5 mL Fe3+硫酸溶液，100℃水浴20 min；水流沖洗冷卻，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 5 mL，［Fe（CN）6］3-溶液 1 mL，在波長680 nm處測定A。同時建立非催化體系（不加β-內(nèi)酰胺酶標準溶液）。

1.6 方法的驗證

1.6.1 專屬性 取800 U／mL青霉素溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別加入 5 mL 的0.01 mol／L Fe3+硫酸溶液（青霉素體系），采用優(yōu)化方法進行檢測；另取相同體積的青霉素溶液，加入β-內(nèi)酰胺酶標準液30.00 mL，30℃水浴30 min，其他步驟同上（青霉素酶催化水解體系）；另取相同體積的青霉素溶液，加入2 mol／L的氫氧化鈉溶10 mL，100℃水浴30 min；用2 mol／L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.7，其他步驟同上（青霉素堿水解體系）。

1.6.2 線性范圍 取5 mL的800 U／mL青霉素溶液，分別加入 β-內(nèi)酰胺酶標準溶液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，即 β-內(nèi)酰胺酶含量為 0、4、8、12、16、20、24 U／mL，采用優(yōu)化條件測定 A。以 β-內(nèi)酰胺酶含量為橫坐標，ΔA為縱坐標，繪制標準曲線。

1.6.3 最低檢出限 取5 mL的800 U／mL青霉素溶液，不加β-內(nèi)酰胺酶標準溶液，平行測定非催化體系10次，計算標準偏差（s），結合標準曲線方程，計算檢測限。

1.6.4 準確性 取1.00 g脫脂奶粉，加入5.0 mL水，混勻，超聲振蕩溶解10 min；加入丙酮定容10 mL，251.5×g離心5 min，取2.50 mL上清液，用蒸餾水定容至25 mL，備用。取脫脂奶粉樣品3份，分別加入 300、400、500 U／mL 的 β-內(nèi)酰胺酶，按優(yōu)化方法檢測酶含量，并按下式計算回收率。

回收率（%）=檢出酶含量／（加標前酶濃度+加標量）×100%

1.7 方法的初步應用 取5.00 g鮮牛奶，加入丙酮，混勻，定容10 mL，于4℃，251.5×g離心5 min，取2.50 mL上清液，用蒸餾水定容25 mL。取鮮牛奶樣品 3 份，分別加入 125、250、375 U／mL 的 β-內(nèi)酰胺酶標準溶液，即終濃度為5、10、15 U／mL，取2.00 mL，采用優(yōu)化方法進行測定。

2 結果

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 最適吸收波長 空白體系不顯色，無特征吸收；非催化體系于680 nm波長處有強吸收；酶催化體系吸光度下降，見圖1。因此確定以680 nm作為測定波長。

圖1 吸收波長的確定Fig.1 Optimization of absorption wavelength

2.1.2 最適Fe3+硫酸溶液用量 Fe3+硫酸溶液在0～2 mL范圍內(nèi)與A680存在良好線性關系，>3 mL時，A680趨于恒定；>5 mL時，A680減小，這是由于大量過剩 Fe3+與普魯士藍 KFeⅢ［FeⅡ（CN）6］結構中［Fe（CN）6］4-發(fā)生了二次反應。見圖2。為減少酶催化體系的測量誤差，確保非催化體系青霉素的完全反應，確定Fe3+硫酸溶液用量為5 mL。

圖2 Fe3+硫酸溶液用量對檢測結果的影響Fig.2 Influence of volume of sulfuric acid solution containing trivalent ferric ion on determination result

2.1.3 最適［Fe（CN）6］3-溶液用量 ［Fe（CN）6］3-溶液>0.8 mL時，體系A680達最大，且保持恒定不變，見圖 3。為確保 Fe2-完全反應，確定最適［Fe（CN）6］3-溶液用量為1 mL。

圖3 ［Fe（CN）6］3-溶液用量對檢測結果的影響Fig.3 Influence of［Fe（CN）6］3-volume on determination result

2.1.4 顯色反應溫度及時間 100℃水浴20 min時，A680達最大，見圖4。因此，確定最適水浴溫度為100℃，加熱時間為20 min。

圖4 不同反應溫度及時間對檢測結果的影響Fig.4 Influence of temperature and time for reaction on determination result

2.1.5 最適顯色反應pH pH為3～5時，A680達最大；pH<3 時，A680減?。籶H>7.5 時，加熱促使Fe3+水解，出現(xiàn) Fe（OH）3褐色沉淀，A680減小。見圖 5。因此選擇pH 4.5為最適顯色反應pH。

圖5 顯色反應pH對檢測結果的影響Fig.5 Influence of pH value for color reaction on determination result

2.1.6 最適酶促反應時間 在0～13 min內(nèi)，△A逐漸增大，13 min時ΔA達最大，隨后趨于恒定，見圖6。因此確定最適酶促反應時間為15 min。

圖6 酶促反應時間對檢測結果的影響Fig.6 Influence of time for enzymatic reaction on determination result

2.2 方法的驗證

2.2.1 專屬性 青霉素酶催化水解體系及青霉素堿水解體系均未與Fe3+發(fā)生反應，僅青霉素體系可與Fe3+發(fā)生反應，見圖7。青霉素酶催化水解產(chǎn)物和青霉素堿水解產(chǎn)物同為青霉噻唑酸，與Fe3+均不發(fā)生反應，F(xiàn)e3+與青霉素反應具有唯一性。

圖7 青霉素及青霉素水解產(chǎn)物與Fe3+反應的對比Fig.7 Comparison of reaction of penicillin and penicillin hydrolysates with trivalent ferric ion

2.2.2 線性范圍 β-內(nèi)酰胺酶標準曲線見圖8。β-內(nèi)酰胺酶在4～24 U／mL范圍內(nèi)與△A呈良好的線性關系，回歸方程為：y=0.091 7 E x-0.512 0，相關系數(shù)（r）=0.998 9，根據(jù)青霉素反應量和反應液吸光度求得表觀摩爾吸光系數(shù)（ε）＝5.46×104L／（mol·cm）。

圖8 β-內(nèi)酰胺酶的標準曲線Fig.8 Standard curve for β-lactamase

2.2.3最低檢出限 平行測定非催化體系10次的s為0.012，最低檢測限為0.32 U／mL。

2.2.4 準確性 加入300、400、500 U／mL的 β-內(nèi)酰胺酶的3份脫脂奶粉樣品的酶濃度分別為215、267、332 U／mL，RSD<1.50%，加標回收率在98.8%～101.2%范圍內(nèi)，見表1。表明該方法具有良好的準確性。

表1 準確性驗證結果（x，n=6）Tab.1 Result of verification test for accuracy（x，n=6）

2.3 方法的初步應用 加入 5、10、15 U／mL β-內(nèi)酰胺酶標準溶液樣品的測定值分別為4.80、9.73、16.1 U／mL，與理論值較接近，相對誤差分別為-4.0、-2.7、7.3。表明新鮮牛奶中不存在β-內(nèi)酰胺酶，同時也表明牛奶中其他物質(zhì)不影響β-內(nèi)酰胺酶殘留的測定。

3 討論

目前，用于檢測牛奶及奶制品中β-內(nèi)酰胺酶含量較為成熟的方法有微生物培養(yǎng)法和碘量法。微生物培養(yǎng)法靈敏性高，但測定周期較長；碘量法方法簡單，不適用于微量分析。本實驗建立了牛奶中β-內(nèi)酰胺酶含量的普魯士藍檢測方法，經(jīng)優(yōu)化后，最適檢測條件為：檢測波長680 nm，F(xiàn)e3+體積5 mL，［Fe（CN）6］3-體積 1 mL，顯色反應水浴溫度 100 ℃，加熱時間20 min，顯色反應pH 4.5，酶促反應時間15 min。

由于青霉素酶催化水解產(chǎn)物和青霉素堿水解產(chǎn)物同為青霉噻唑酸［7］，青霉素水解產(chǎn)物青霉噻唑酸與Fe3+均不發(fā)生反應。本實驗結果表明，青霉素酶催化水解體系及青霉素堿水解體系均未與Fe3+發(fā)生反應，僅青霉素體系可與Fe3+發(fā)生反應，表明Fe3+與青霉素反應具有唯一性。β-內(nèi)酰胺酶在4～24 U／mL范圍內(nèi)與ΔA呈良好的線性關系，回歸方程為：y=0.0917Ex-0.5120，r=0.9989，檢出限為 0.32U／mL，明顯優(yōu)于前期報道的 pH 法（15和 8.29 U／mL）［9-10］。加標試驗結果表明，加標回收率在98.8%～101.2%范圍，表明本實驗建立的方法準確性良好。

采用優(yōu)化方法對新鮮牛奶樣品進行檢測，測定值與理論值較接近，相對誤差在-4.0～7.3范圍內(nèi)，表明新鮮牛奶中不存在β-內(nèi)酰胺酶，也表明牛奶中其他物質(zhì)不影響β-內(nèi)酰胺酶殘留的測定。綜上所述，本實驗建立的方法具有良好的線性及準確性，且簡便、省時，可用于牛奶及奶制品中β-內(nèi)酰胺酶含量的檢測。