吳婷婷，韓曉燕，李欣，納濤，袁寶珠

中國食品藥品檢定研究院細胞資源保藏及研究中心，北京 100050

人間充質(zhì)干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）是一類具有有限自我更新和多向分化潛能，廣泛存在于胎兒和成人各組織中的成體干細胞［1］。由于hMSCs來源廣泛且具有獨特的免疫調(diào)控功能和組織再生功能［2-3］，已成為干細胞治療中研究最為廣泛的干細胞類型。但有關(guān)hMSCs的治療研究仍存在巨大挑戰(zhàn)［4］，主要是缺乏hMSCs生物學有效性這一質(zhì)量屬性的標準研究［5-6］，以致目前仍缺乏對臨床研究用hMSCs進行有效評價的質(zhì)量標準，更無法對臨床研究結(jié)果進行客觀預(yù)測。hMSCs生物學有效性質(zhì)量屬性中的重要組成部分為hMSCs的免疫調(diào)控功能［7-8］，其中研究最為廣泛和深入的是hMSCs對CD4+T淋巴細胞各亞群的功能及亞群之間平衡的調(diào)控功能［9］，如hMSCs可抑制促炎性的Th1／Th17淋巴細胞亞群分化以及增殖［10］，同時促進調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）的分化［11］。Th17細胞是一類以分泌IL-17A為主的與自身免疫性疾病［12］和／或慢性炎癥疾?。?3］發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的促炎性CD4+T淋巴細胞亞群［14］，hMSCs對Th17的抑制能力是其體內(nèi)治療相關(guān)疾病的重要機制［15-18］，也是hMSCs免疫調(diào)控功能中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

我們利用前期建立的hMSCs標準細胞CCRCMSC-S1（以下簡稱為 CCRC1）［19］作為評價用標準細胞（即參比細胞），建立了以細胞共培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)的hMSCs抑制Th17細胞增殖的標準評價體系。在此基礎(chǔ)上，對50個不同個體和組織來源的hMSCs逐一進行相關(guān)質(zhì)量屬性評價，并用參比細胞的參比值對每一獨立評價的hMSCs數(shù)據(jù)進行校正，進而獲得hMSCs抑制Th17細胞增殖質(zhì)量屬性的初級標準值（即51.98%）。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，對hMSCs特定質(zhì)量屬性標準進行進一步探索。該研究填補了目前國內(nèi)外相關(guān)空白，對不同組織來源、不同生產(chǎn)工藝、不同傳代階段的hMSCs質(zhì)量屬性的客觀評價具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 細胞 CCRC1（hMSCs生物學有效性質(zhì)量評價用標準細胞株［10］）為本中心前期構(gòu)建；其他hMSCs共50株，分別為臍帶來源30株（UC-1～UC-30）、胎盤來源4株（PL-1～PL-4）、羊膜來源3株（AM-1～AM-3）、骨髓來源 3株（BM-1 ～ BM-3）、脂肪組織來源 5株（AT-1～ AT-5）、齒齦來源1株（G-1）、牙髓來源4株（DP-1～DP-5），均經(jīng)本中心綜合的hMSCs生物學屬性鑒別和微生物學安全性檢測，所有hMSCs均使用含10%胎牛血清的α-MEM進行常規(guī)培養(yǎng)；PBMCs由人濃縮白細胞（由北京紅十字血液中心提供），經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離制備。

1.2 主要試劑及儀器 人淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司（LTS1077）；α-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；佛波酯（phorbol esters，PMA）和離子霉素（ionomycin）購自美國Sigma-Aldrich?公司；布雷桿菌素（Brefeldin A，BFA）購自美國Cell Signaling Technologies公司；固定和破膜液Fix & Perm購自美國Invitrogen公司；流式細胞染色抗體CD8-FITC（BD555366）、IL-17A-PE（BD560486）、PE iostype control（BD559320）、CD3-PerCP-Cy5.5（BD560835）和BD FACSCalibur流式細胞儀均購自美國BD公司。

1.3 PBMCs的制備 取抗凝外周血或白細胞成分血15 mL，加入15 mL室溫PBS稀釋；取20 mL室溫淋巴細胞分離液加入50 mL離心管中，將稀釋后的血細胞緩慢加至淋巴細胞分離液上，并保持兩者界面清晰，室溫下800×g離心20 min，離心時將加速和減速均調(diào)至0檔；用移液管小心吸棄上層血漿，再用移液管輕輕吸出單個核細胞層，移入干凈的50 mL離心管中，加入30 mL PBS充分混勻，800×g離心10 min，離心時將減速檔調(diào)至最大值；棄上清，輕彈細胞沉淀使其散開，加入30 mL PBS充分混勻，200×g離心10 min；棄上清，輕彈細胞沉淀使其散開，加入30 mL PBS并充分混勻，150×g離心10 min；棄上清，輕彈細胞沉淀使其散開，用5 mL含10%FBS的RPMI1640重懸單個核細胞，用臺盼蘭染色法計數(shù)活細胞數(shù)，并計算細胞存活率。調(diào)整細胞濃度為5×106個／mL。

1.4 hMSCs的培養(yǎng)和制備 從液氮中復(fù)蘇待測hMSCs和CCRC1，用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）培養(yǎng)1代，待細胞融合達80%時經(jīng)0.25%胰酶消化，200×g離心5 min，吹散細胞沉淀，制成密度為1×106個／mL的細胞懸液。

1.5 不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)hMSCs不同組成成分的體外培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)基）對hMSCs的免疫調(diào)控能力影響很大。目前常用的hMSCs培養(yǎng)基主要分為三類：含胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基，不含動物血清但使用人血小板裂解物的血清替代培養(yǎng)基以及化學成分確定的無血清培養(yǎng)基。將兩株臍帶間充質(zhì)干細胞hUC-MSCs-1和hUC-MSCs-2分別用M1（含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基）、M2（含5%人血小板裂解物不含血清的培養(yǎng)基）和M3培養(yǎng)基（化學成分限定培養(yǎng)基）于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)2代后，檢測其抑制Th17能力的差異。其中hUC-MSCs-1原始培養(yǎng)基為M1，hUC-MSCs-2原始培養(yǎng)基為M2。待細胞融合達80%時，按1∶4傳代。

1.6 PBMCs中Th17細胞的檢測 采用流式細胞術(shù)，按照文獻［20］方法。在12孔培養(yǎng)板中每孔加入1 mL含1×106個PBMCs的懸液，再加入淋巴細胞激活劑PIB（PMA 50 ng／mL+ionomycin 1μg／mL+BFA 10μg／mL）刺激活化PBMCs6～8h；吸出懸浮的PBMCs，置入1.5 mL新鮮離心管中，350×g室溫離心5 min，棄上清，各管加入100 μL PBS懸浮細胞，并加入antihu-CD8-FITC和 anti-hu-CD3-PerCP-Cy5.5抗體染色，4℃避光孵育 20 min；加入50 μL Fix & Perm 中的 Reagent A，室溫避光孵育20 min；加入1 mL PBS懸浮細胞，500×g室溫離心5 min，棄上清，加入50 μL Fix & Perm的Reagent B懸浮細胞，加入10 μL PE isotype control（Ms IgG1，κ）或anti-hu-IL-17A-PE，室溫下避光孵育30 min，期間輕輕振蕩1次；每管中加入1 mL PBS（含 5%FBS），500×g離心 5 min，棄上清，用0.3 mL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測，用FCS Express V3軟件進行分析。分析時用R1（CD3+SSC）區(qū)域選定CD3+T細胞。設(shè)門于R1，CD8-IL-17A+的細胞為Th17，并計算Th17在CD3+T細胞中的比例。

1.7 hMSCs對Th17增殖抑制能力的標準化檢測 將CCRC1作為標準對照細胞，對不同個體、不同組織來源的待測hMSCs進行Th17增殖抑制能力的標準化檢測。將CCRC1或其他hMSCs按2×105個／孔接種于12孔板中，補充含10%FBS的RPMI1640至1 mL／孔，各組設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入1×106個PBMCs（PBMCs與hMSCs的比例為5︰1），過夜孵育18 h；加入PIB作用6 h，進行Th17的流式檢測。試驗分為4組：不含PIB的PBMCs對照組A、加入PIB的PBMCs對照組B以及與CCRC1共培養(yǎng)組、與待測hMSCs共培養(yǎng)組。按下式計算CCRC1和hMSCs對Th17的增殖抑制率。為排除各種檢測因素（特別是PMSCs質(zhì)量不均一的因素）所致的不同試驗間的差異，確保不同來源hMSCs所獲得數(shù)據(jù)的客觀性和可比性，利用每次檢測中CCRC1組的Th17增殖抑制率以及CCRC1對Th17增殖抑制率的初級標準值（52.83%），對同次試驗中待測hMSCs組的Th17增殖抑制率進行校正（或標準化處理），得出每一待測hMSCs對Th17的相對增殖抑制率。

增殖抑制率（%）=［1-（待測細胞組Th17%-對照組A Th17%）／（對照組B Th17%-對照組A Th17%）］×100%；

相對增殖抑制率（%）=待測hMSCs對Th17的增殖抑制率／CCRC1對Th17增殖抑制率×52.83%

2 結(jié)果

2.1 hMSCs調(diào)控Th17淋巴細胞檢測方法的建立 30個不同個體來源新鮮或凍存1個月以內(nèi)的PBMCs中Th17的檢測結(jié)果顯示，PBMCs中Th17所占比例在PIB激活前為（0.04±0.01）%，而經(jīng)PIB激活后為（0.86±0.17）%，見圖1。對4個不同個體來源的PBMCs經(jīng)凍存不同時間后復(fù)蘇進行Th17檢測，結(jié)果顯示，凍存1年的PBMCs中Th17所占比例可降低約50%，見表1，因此后續(xù)只使用新鮮制備或凍存半年以內(nèi)的PBMCs進行相關(guān)試驗。

表1 凍存時間對PBMCs中Th17百分數(shù)的影響（%，±s，n=4）Tab.1 Effect of freezing time on percentage of Th17 in PBMCs（%，±s，n=4）

表1 凍存時間對PBMCs中Th17百分數(shù)的影響（%，±s，n=4）Tab.1 Effect of freezing time on percentage of Th17 in PBMCs（%，±s，n=4）

供者 新鮮制備 凍存1個月 凍存6個月 凍存1年1 1.14±0.10 1.03±0.09 0.88±0.05 0.57±0.12 2 0.85±0.08 0.75±0.04 0.66±0.06 0.46±0.04 3 0.97±0.06 0.89±0.08 0.83±0.06 0.60±0.06 4 0.67±0.04 0.53±0.05 0.41±0.04 0.32±0.04 Mean±SD 0.91±0.19 0.80±0.20 0.69±0.20 0.48±0.13

圖1 PBMCs中Th17檢測方法的建立（±s，n=4）Fig.1 Establishment of detection method for Th17 in PBMCs（±s，n=4）

2.2 hMSCs抑制人PBMCs中Th17標準評價方法的確立 將CCRC1與PBMCs按不同比例（1∶20～1∶2.5）混合共培養(yǎng)后檢測PBMCs中Th17百分數(shù)變化的結(jié)果顯示，CCRC1抑制經(jīng)PIB激活的PBMCs中Th17存在劑量依賴效應(yīng)，當CCRC1與PBMCs的比例為1∶20時，CCRC1即可表現(xiàn)出對Th17的抑制效應(yīng)，而比例為1∶5時，抑制效應(yīng)基本達到平臺期，CCRC1 與 PBMCs的比例為 1∶20、1∶10、1∶5、1∶2.5時CCRC1對Th17的增殖抑制率分別為（31.68±5.5）%、（38.68 ± 2.5）%、（46.86 ± 3.1）%和（48.50 ±1.8%）。見圖2。后續(xù)共培養(yǎng)試驗中，均使用1∶5作為hMSCs和PBMCs共培養(yǎng)細胞比例。

圖2 hMSCs抑制人PBMCs中Th17標準評價方法的確立Fig.2 Establishment of a standard assay for evaluation of suppressive potency of hMSCs to Th17 in PBMCs

2.3 CCRC1對Th17增殖抑制率的初級標準值確定 將CCRC1與符合上述選擇標準的獨立供者來源的不同PBMCs分別進行Th17增殖抑制試驗，對Th17增殖抑制數(shù)據(jù)的有效性進行分析發(fā)現(xiàn)，當供者PBMCs經(jīng)PIB處理后Th17含量過低［比例小于（0.3±0.1）%］時，CCRC1失去對Th17的增殖抑制作用（P=0.57，n=5），見圖 3A，因此將 PBMC 加入PIB后Th17的比例低于0.3%的處理視為無效處理，相應(yīng)的共培養(yǎng)試驗視為無效試驗。排除無效試驗后，從50次有效試驗中統(tǒng)計出CCRC1對Th17增殖抑制率分布區(qū)間為（52.83±6.17）%，見圖3B（n=50），隨后以52.83%作為CCRC1對Th17增殖抑制率的初級標準值，并將其應(yīng)用于對后續(xù)其他來源hMSCs抑制Th17增殖試驗數(shù)據(jù)的矯正和質(zhì)量標準研究中。

圖3 CCRC1對Th17增殖抑制率的初級標準值計算Fig.3 Calculation of primary standard value for inhibitory rate of proliferation of Th17 in PBMCs by CCRC1

2.4 利用CCRC1和標準評價方法對其他hMSCs的Th17增殖抑制能力進行的標準化檢測 檢測結(jié)果顯示，不同組織來源的hMSCs對Th17均有不同程度的抑制作用，見圖4和圖5。30株臍帶來源hMSCs對Th17的增殖抑制率以及相對增殖抑制率見表2。20株其他組織來源hMSCs對Th17的增殖抑制率以及校正后的相對增殖抑制率見表3。30株臍帶來源hMSCs對Th17的相對增殖抑制率均值為（49.59±13.13）%。30株臍帶以及20株其他組織來源的共50株hMSCs對Th17的相對增殖抑制率均值為（51.98±12.99）%。由此得出hMSCs對Th17相對增殖抑制率的初級標準值為51.98%。

圖4 不同組織來源hMSCs與PBMSCs共培養(yǎng)后對Th17百分數(shù)的影響Fig.4 Effect of co-culture of hMSCs and PBMSCs from various tissue origins on percentage of Th17

圖5 不同組織來源hMSCs對Th17增殖抑制率的統(tǒng)計分析Fig.5 Statistical analysis of inhibitory rates of Th17 proliferation by hMSCs for various tissue origins

表2 30株臍帶來源hMSCs對Th17增殖抑制率（%）以及校正后的Th17相對增殖抑制率（%）Tab.2 Inhibitory rate（%）and relative inhibitory rate（%）of Th17 proliferation by hMSCs from umbilical cord

表3 20株非臍帶組織來源hMSCs對Th17的增殖抑制率（%）以及校正后的Th17相對增殖抑制率（%）Tab.3 Inhibitory rate（%）and relative inhibitory rate（%）of Th17 proliferation by non-umbilical cord-derived hMSCs

2.5 標準評價方法及初級質(zhì)量標準值的應(yīng)用

2.5.1 同一個體來源不同代次hMSCs對Th17增殖抑制能力的評價 應(yīng)用標準評價方法評估同一個體來源不同代次hMSCs對Th17增殖抑制能力的差異，結(jié)果顯示，3株臍帶組織來源的hMSCs（UC-1、UC-2和 UC-3）在第 5和第 10代次（P5和 P10）對Th17的增殖抑制能力存在差異，UC-1的P5和P10與UC-3的P5和P10之間差異無統(tǒng)計學意義（P分別為0.09和0.30）；而UC-2的P10能力低于P5（P=0.012）。兩株胎盤 hMSCs（PL-1 和 PL-2）的 P5 和P10之間差異無統(tǒng)計學意義（P分別為0.19和0.51）。羊膜 hMSCs（AM-1）的 P10 能力高于 P5（P=0.022）。骨髓 hMSCs（BM-1）的 P10 能力低于 P5（P=0.015）。脂肪 hMSC（AD-1）的 P10 能力低于 P5（P=0.011）。見圖6。

圖6 不同組織、不同個體、不同代次的hMSCs對Th17增殖抑制效應(yīng)的影響Fig.6 Inhibitory rates of hMSCs of various passages from various tissues and individuals on Th17 proliferation

2.5.2 不同培養(yǎng)條件對hUC-MSCs抑制Th17增殖能力影響的評估 兩株不同的hUC-MSCs在3種不同培養(yǎng)體系（M1、M2、M3培養(yǎng)基）下培養(yǎng)后檢測其抑制Th17能力的差異，結(jié)果顯示，hUC-MSCs-1在M3中培養(yǎng)后其抑制Th17的功能顯著降低，與其原始培養(yǎng)基M1相比，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 6）；而在M2中培養(yǎng)后無顯著變化，與其原始培養(yǎng)基M1相比，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.187）。hUC-MSCs-2經(jīng)M1和M3培養(yǎng)后，抑制Th17的功能與其在原始培養(yǎng)基M2培養(yǎng)相比，均顯著降低（P分別為0.004 8和0.001 7）。見圖7。表明不同培養(yǎng)體系對hMSCs抑制Th17增殖的功能影響很大，其中某化學成分確定的無血清培養(yǎng)條件對相關(guān)功能的影響最為顯著。同時也說明，細胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的改變對hMSCs調(diào)控Th17功能的影響很大。

圖7 不同培養(yǎng)條件對hMSCs抑制Th17的影響Fig.7 Effect of culture conditions on inhibitory rate of Th17 proliferation by hMSCs

3 討論

本研究在以往成功建立1株hMSCs生物學有效性質(zhì)量評價用標準細胞CCRC1細胞株的基礎(chǔ)上，進一步建立了hMSCs調(diào)控Th17功能的標準化評價技術(shù)和相關(guān)功能的初級質(zhì)量標準。由于hMSCs調(diào)控Th17的功能是其免疫調(diào)控功能參與治療各種不同臨床適應(yīng)癥所需的重要細胞生物學基礎(chǔ)，因此也是hMSCs生物學有效性中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。本研究為有效評價hMSCs的這一關(guān)鍵質(zhì)量屬性提供了量化的、確證性的方法學基礎(chǔ)和初級質(zhì)量標準，為創(chuàng)造性地構(gòu)建hMSCs標準化生物學有效性質(zhì)量評價體系進一步充實了重要內(nèi)容。

hMSCs通過細胞間直接相互作用和分泌不同免疫調(diào)控活性因子的方式綜合調(diào)控Th17增殖和/或活性［21］。如 hMSCs可通過細胞表面表達Notch、PDL-1、FasL等，與不同分化階段的Th17細胞相互作用從而抑制其功能［22-24］，也可通過分泌細胞外泡（如外泌體、線粒體等）［25-26］以及表達 IDO1、HO-1、PGE2、HGF等因子抑制Th17分化、增殖和功能［27-29］。而越來越多的證據(jù)顯示，hMSCs是通過調(diào)節(jié)Th17和Tregs之間的平衡來有效改善體內(nèi)炎性環(huán)境［9，15］。上述研究均說明，對Th17細胞增殖和活性的抑制是hMSCs在免疫調(diào)控功能生物學有效性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。而本研究建立的標準化評價技術(shù)是在一定程度上對上述這些功能進行綜合評價。因此，相關(guān)標準評價技術(shù)在生物學機制的關(guān)聯(lián)性方面既具有確證性，又具有代表性。

建立hMSCs生物學有效性質(zhì)量評價體系的核心是建立各生物學有效性關(guān)鍵質(zhì)量屬性評價用標準細胞株［12］，該細胞株除需滿足所有hMSCs的基本生物學特性外，還需具有hMSCs各生物學有效性質(zhì)量屬性的代表性和穩(wěn)定性。通過前期研究我們確立了CCRC1作為該標準細胞株。而本研究進一步證明了該標準細胞株在建立新的生物學有效性關(guān)鍵質(zhì)量屬性的標準化評價技術(shù)和相關(guān)質(zhì)量標準研究方面具有重要意義。

為使CCRC1發(fā)揮其參比細胞的作用，本研究首先獲得了CCRC1自身調(diào)控Th17功能的初級標準值，再應(yīng)用CCRC1及其初級標準值共同參與每一獨立hMSCs相關(guān)功能的檢測，且每一檢測結(jié)果均需用CCRC1的初級標準值進行校正，以排除檢測中可能存在的系統(tǒng)誤差。這種以標準參比細胞和相關(guān)標準值為基礎(chǔ)的評價技術(shù)是hMSCs生物學質(zhì)量屬性標準評價技術(shù)的基本內(nèi)涵。

與該標準評價技術(shù)相關(guān)的最為關(guān)鍵和最難控制的誤差是檢測試驗中所使用的PBMCs的質(zhì)量因素。本研究中并未采用純化的Th17誘導(dǎo)分化體系進行hMSCs調(diào)控Th17的檢測，而是采用了更加簡單快速、以PBMCs直接與MSCs共培養(yǎng)的基本方法，這種檢測方法與FDA所發(fā)表的檢測方法相一致［30-31］。但PBMCs質(zhì)量的均一性是最為關(guān)鍵的影響因素，且其質(zhì)量均一性是多方面的。首先，試驗中所使用的PBMCs的來源為同種異體的不同健康供者，盡管是健康供者來源，但不同供者個體間可能存在多方面的細胞生物特性的差異，相關(guān)差異在本研究中可表現(xiàn)為對PIB激活劑反應(yīng)性的差異和各自Th17含量的差異。因此，我們首先利用CCRC1對PMBCs的相關(guān)質(zhì)量進行研究，排除了因?qū)せ顒┓磻?yīng)差和Th17絕對數(shù)量過低導(dǎo)致經(jīng)PIB激活后Th17比例低于一定數(shù)量（如0.3%）的PBMCs的實驗結(jié)果，同時獲得了CCRC1調(diào)控Th17的初級標準值。其次，PBMCs的（液氮）凍存時間（以半年為關(guān)鍵時間點）相關(guān)的質(zhì)量因素也是影響檢測結(jié)果的重要因素，而本研究也排除了凍存時間超過半年的PBMCs的使用。

在標準細胞CCRC1、CCRC1調(diào)控Th17的初級標準值和對PBMCs進行質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，我們隨即開展了hMSCs調(diào)控Th17功能的初級質(zhì)量標準值的研究，選擇了50個符合hMSCs綜合性質(zhì)量要求的不同個體、不同組織來源的hMSCs作為研究對象，并逐一對每個hMSCs進行相關(guān)檢測。而每一獨立檢測中，均設(shè)置CCRC1作為參比細胞，并用CCRC1的初級標準值對每一獨立檢測結(jié)果進行校正，最終計算出50株hMSCs調(diào)控Th17功能的平均值（即51.98%）。理論上，該經(jīng)過標準化評價技術(shù)在符合綜合質(zhì)量屬性的hMSCs中所獲得的平均值，就具有hMSCs調(diào)控Th17質(zhì)量屬性的初級標準值的性質(zhì)。

需要強調(diào)的是，本研究是在建立標準化評價技術(shù)的基礎(chǔ)上，對hMSCs調(diào)控Th17的質(zhì)量屬性標準的探索性工作，所獲得的標準值只具有“初級標準”的意義。將其界定為“初級標準”而非“最終標準”的主要考慮是，研究中只使用了有限的樣本數(shù)量，包括獲得CCRC1初級標準值時所使用的PBMCs的數(shù)量（50例）和獲得正常hMSCs初級標準值的hMSCs數(shù)量（50例）。其次，50例正常hMSCs各組織來源的數(shù)量差異也較大，以臍帶組織來源所占比例最高。后續(xù)在hMSCs調(diào)控Th17的質(zhì)量屬性標準進一步精準化研究中，可加大相關(guān)研究所需的PBMCs數(shù)量和正常hMSCs的數(shù)量，并盡可能保障不同hMSCs來源組織數(shù)量的均衡性，同時還需優(yōu)化對實驗結(jié)果的數(shù)學分析和探索更加合理的標準值表達方式，以保證新的質(zhì)量標準值更具有合理性，并不斷接近“最終標準”。

本研究所創(chuàng)立的方法學在hMSCs質(zhì)量研究領(lǐng)域中未見報道。研究成果中的標準化評價技術(shù)和初級標準值，已可直接應(yīng)用于滿足現(xiàn)階段國家干細胞“臨床研究備案”和“臨床試驗注冊”相關(guān)的hMSCs質(zhì)量控制的需要［32-33］。例如，利用本研究所建立的質(zhì)量標準評價技術(shù)對不同研發(fā)者的hMSCs進行評價時，發(fā)現(xiàn)不同研發(fā)者間hMSCs調(diào)控Th17的能力差異巨大，差異范圍可在20%～80%之間。這些質(zhì)量評價的實踐性成果進一步說明了新建立的標準化評價技術(shù)在hMSCs質(zhì)量管理中的應(yīng)用價值。

除直接應(yīng)用于hMSCs產(chǎn)品的質(zhì)量評價外，本研究所建立的標準化質(zhì)量評價技術(shù)也可用于指導(dǎo)hMSCs制備工藝的研發(fā)和工藝質(zhì)量控制。例如，本研究應(yīng)用所建立的標準化評價技術(shù)，探索了與hMSCs制備工藝相關(guān)的體外細胞傳代次數(shù)和培養(yǎng)體系對hMSCs調(diào)控Th17功能的影響，并發(fā)現(xiàn)在有限傳代次數(shù)內(nèi)，代次的高低與相關(guān)功能不存在特定關(guān)系。而培養(yǎng)體系的不同對相關(guān)功能影響巨大，其中含血小板裂解物的培養(yǎng)體系較有利于提高hMSCs調(diào)控Th17的功能，而成分確定的無血清培養(yǎng)體系則會大大降低該功能。該有關(guān)培養(yǎng)體系的研究結(jié)果與目前人們在hMSCs產(chǎn)品研發(fā)領(lǐng)域中的認知基本相符。因此，建議未來在hMSCs產(chǎn)品研發(fā)和質(zhì)量管理方面，規(guī)定合理細胞代次或選擇合理培養(yǎng)體系時，特別是對于成分明確的無血清培養(yǎng)體系進行選擇或開發(fā)時，應(yīng)嚴格基于產(chǎn)品特定質(zhì)量控制的研究成果，而不應(yīng)進行機械性地規(guī)定。

本研究只涉及hMSCs調(diào)控Th17功能的標準評價技術(shù)建立及相關(guān)質(zhì)量標準的研究，未來還需分別建立hMSCs免疫調(diào)控其他質(zhì)量屬性的標準化評價技術(shù)和相關(guān)質(zhì)量標準，如hMSCs調(diào)控Th1、Treg和巨噬細胞等的功能。由于hMSCs調(diào)控所有免疫細胞的基本細胞分子機制均是通過細胞間直接相互作用和分泌免疫調(diào)控活性因子，因此本研究所建立的方法學對這些關(guān)鍵質(zhì)量屬性的標準化研究均具有重要的指導(dǎo)意義。未來所要研發(fā)和建立的針對所有這些關(guān)鍵質(zhì)量屬性的標準化評價方法和質(zhì)量標準，將共同構(gòu)成hMSCs免疫調(diào)控相關(guān)生物學有效性綜合質(zhì)量評價體系，并用于綜合評價hMSCs質(zhì)量、指導(dǎo)hMSCs的產(chǎn)品研發(fā)及臨床應(yīng)用。