尹金良，徐文，郭占龍，郭丹丹，姚為民，趙大鵬，張雪梅，常軍亮，吳業(yè)紅

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130012

目前，流感疫苗仍主要在雞胚中生產(chǎn)，但存在生產(chǎn)周期長、易污染、操作繁瑣、工作量大、不易于質(zhì)量控制等缺點，如發(fā)生禽流感時，雞胚供應(yīng)還會嚴(yán)重限制疫苗的生產(chǎn)及產(chǎn)量，因此，WHO積極推薦各國以哺乳動物細(xì)胞部分替代雞胚生產(chǎn)流感疫苗［1］。MDCK細(xì)胞是Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel犬腎臟組織中分離培育建立的細(xì)胞株［2］，由于其病毒感染效率高，增殖快，且不易變異，被公認(rèn)為是最適于流感病毒繁殖的3種細(xì)胞系之一［3］。目前國外已有兩家公司的懸浮MDCK細(xì)胞基質(zhì)亞單位流感疫苗上市，臨床結(jié)果顯示，免疫原性和安全性與雞胚流感疫苗相當(dāng)［3］。

在以傳代細(xì)胞系作為疫苗生產(chǎn)基質(zhì)制備疫苗的過程中，生產(chǎn)的病毒收獲液經(jīng)下游純化后可能會有宿主細(xì)胞蛋白的殘留。宿主細(xì)胞殘留蛋白可能會引起機體過敏反應(yīng)，并對疫苗等生物制品的免疫效果產(chǎn)生一定的影響［4］。宿主細(xì)胞蛋白在生物制品中的殘留量反映的不僅是制品批間的一致性，還是衡量生物制品質(zhì)量的一個重要指標(biāo)［5］?！吨袊幍洹啡浚?015版）中對基于傳代細(xì)胞培養(yǎng)的病毒性疫苗的宿主細(xì)胞蛋白（host cell protein，HCP）含量控制提出了一定要求，如基于Vero細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的凍干乙型腦炎滅活疫苗的Vero細(xì)胞HCP殘留質(zhì)量濃度應(yīng)不高于 2 μg／mL［6-7］。因此，控制生物制品中的宿主細(xì)胞殘留蛋白含量是保證疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

目前，檢測生物制品中宿主細(xì)胞殘留蛋白含量的方法有SDS-PAGE、HPLC、毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜法、ELISA、Western blot等。Western blot法只能進行限量分析，靈敏度低，通常達(dá)不到質(zhì)控要求。其他方法如HPLC或SDS-PAGE檢測殘留蛋白均是以相對分子質(zhì)量大小為基礎(chǔ)，而雙抗體夾心ELISA法可特異性檢測殘留蛋白［8-9］。雙抗體夾心ELISA是檢測細(xì)胞基質(zhì)來源的殘留蛋白的主要方法之一［10］，該方法靈敏度較高，特異性較強，穩(wěn)定性好，已廣泛應(yīng)用于各種抗原檢測［11］。雙抗體夾心ELISA法中關(guān)鍵的一部分是制備多克隆抗體，本研究旨在制備MDCK宿主細(xì)胞殘留蛋白多克隆抗體，并進行鑒定及初步應(yīng)用，為進一步建立HCP-ELISA檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 無血清懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司馴化并保存，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒純化工藝各階段樣品由該公司制備。

1.2 實驗動物 SPF級新西蘭兔，8周齡，雌性，體重2.0～2.5 kg，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司實驗動物室提供，動物合格證號：201900028024。

1.3 主要試劑及儀器 陰離子交換介質(zhì)DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠購自美國Pharmacia Biotech公司；Protein A凝膠購自博格?。ㄉ虾＃┥锛夹g(shù)有限公司；硫酸銨購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；弗氏佐劑購自美國Sigma公司；PEG20000、透析袋、TMB試劑盒和DAB試劑盒購自美國Solarbio公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維膜購自美國Pall Corporation公司；層析柱（GE16／200）購自美國GE公司；酶標(biāo)板購自美國Thermo公司。

1.4 抗原的制備及鑒定 無血清懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，173.9×g離心5 min濃縮細(xì)胞，PBS洗滌3次，將細(xì)胞懸液平均分為3份，第1份通過反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，反復(fù)凍融5次，獲得細(xì)胞懸液；第2份用裂解液裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞懸液；第3份采用超聲裂解的方法裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞懸液。裂解獲得的細(xì)胞懸液經(jīng)1 391.3×g離心20 min去除細(xì)胞碎片，取上清液獲得HCP抗原，進行12%SDS-PAGE分析；反復(fù)凍融獲得的細(xì)胞懸液經(jīng)不同離心力（173.9、521.7、869.6、1 391.3、1 739.1 × g）離心 20 min，Lowry法測定蛋白濃度，SDS-PAGE分析蛋白相對分子質(zhì)量。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色12 h，脫色4 h后拍照分析。

1.5 動物免疫 抗原用生理鹽水稀釋至2 mg／mL，與弗氏佐劑按1︰1混合乳化，制成1 mg／mL均勻的油包水狀抗原乳劑。經(jīng)背部多點皮下免疫新西蘭兔，每點0.1 mL。首次免疫1 mg／只，免疫劑量逐次遞增0.15 mg，共免疫8次，間隔7 d。末次免疫10 d后，耳緣靜脈采血，分離血清，檢測抗體效價。當(dāng)抗體效價≥1×106時，家兔頸動脈采血，分離血清并分裝，于-20℃儲存。

1.6 血清抗體效價的檢測 采用間接ELISA法。將抗原蛋白濃度稀釋至5 μg／mL，包被96孔板，100 μL／孔，4℃包被 24 h；加入 20%小牛血清，150 μL／孔，4 ℃封閉 16 h；拍干，加入經(jīng)抗體稀釋液稀釋的抗體，另設(shè)陰性對照（PBS）2孔，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，拍干，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（工作濃度 1∶8 000），37 ℃孵育 45 min；PBST洗滌5次，拍干，加入TMB底物A、B液，顯色15 min；2 mol／L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取各孔A450值。以多克隆抗體A450（P）／陰性對照A450（N）>2為抗體效價。

1.7 多克隆抗體的粗純 采用硫酸銨兩步鹽析法粗提多克隆抗體。取10 mL兔血清，與等量生理鹽水混合，加入2倍兔血清體積的飽和硫酸銨，用終濃度50%的硫酸銨鹽析沉淀抗體，1 360×g離心30 min，去上清，PBS溶解沉淀，再加入飽和硫酸銨，用終濃度33%的硫酸銨鹽析沉淀抗體，1 360×g離心30 min，去上清，PBS溶解沉淀，裝入透析袋流水透析4 h，521.7×g離心10 min，去沉淀，獲得抗體溶液。

1.8 多克隆抗體的精純

1.8.1 DEAE柱精純 層析柱：ID=1.6 cm，H=20 cm，裝柱（h=15 cm，30 mL膠），抗體用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）平衡過夜，DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠裝柱，平衡液緩沖16個柱體積，流速：8 mL／min；按2 mL／min上蛋白樣，上樣量10 mL，平衡液平衡；收集流穿樣，用1 mol／L氯化鈉洗滌雜蛋白，0.1 mol／L氫氧化鈉洗滌3個柱體積，0.1 mol／L鹽酸洗滌3個柱體積，再用0.1 mol／L氫氧化鈉洗3個柱體積，純化水平衡至中性，20%乙醇保存柱介質(zhì)。純化后的樣品用PEG20000濃縮，PBS透析，獲得純化后的抗體。

1.8.2 Protein A純化 層析柱：ID=1.6 cm，H=20 cm，裝柱（h=15c m，30 mL膠），抗體溶液用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 8.0）平衡過夜，Protein A凝膠裝柱，平衡液緩沖10個柱體積至pH 8.0，按1 mL／min上樣，上樣量10 mL，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 8.0）淋洗，磷酸氫二鈉-檸檬酸（pH 3.0）洗脫，用Tris-HCL（pH 8.0）緩沖液調(diào)節(jié)樣品pH值，洗脫后的層析柱用平衡液平衡至pH 8.0，20%乙醇保存。樣品進行12%非還原型SDS-PAGE分析。

1.9 純化抗體的Western blot鑒定 將蛋白樣品稀釋至0.5 mg／mL，經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以20%小牛血清室溫25℃下封閉2 h；TBS-T洗滌3次，加入抗體（1︰2 000稀釋），4℃孵育過夜；TBS-T洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1︰2 000稀釋），室溫25℃下孵育2 h；TBS-T洗滌5次，用DAB試劑盒顯色。

1.10 多克隆抗體的應(yīng)用 收集MDCK細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒純化工藝各階段樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，通過Western blot鑒定各階段樣品的宿主細(xì)胞殘留蛋白，以純化的多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，步驟同1.9項。

2 結(jié)果

2.1 抗原的鑒定 SDS-PAGE分析顯示，3種方法獲得的HCP抗原蛋白較多，相對分子質(zhì)量大小一致，從20 100～97 200均有分布，見圖1，因此選擇無化學(xué)試劑添加、無超聲溫度影響的反復(fù)凍融裂解方法。不同離心力獲得的抗原蛋白相對分子質(zhì)量大小一致（圖2），抗原蛋白濃度相差很?。ū?），表明不同離心力對細(xì)胞蛋白的分離無影響。

表1 不同離心力獲得的抗原的蛋白濃度（mg／mL）Tab.1 Protein concentrations of antigens obtained at different centrifugal forces（mg／mL）

圖1 不同裂解方法獲得的抗原的SDS-PAGE鑒定Fig.1 SDS-PAGE profile of antigens obtained by different lysis methods

圖2 SDS-PAGE分析不同離心力獲得的抗原Fig.2 SDS-PAGE profile of antigens obtained at different centrifugal forces

2.2 血清效價 間接ELISA檢測結(jié)果顯示，1號家兔血清效價為160 000，2號家兔血清效價為320 000，均符合預(yù)期值。用裂解細(xì)胞獲得的全細(xì)胞蛋白抗原免疫家兔可產(chǎn)生效價較高的多克隆抗體。2號家兔效價優(yōu)于1號家兔，因此后續(xù)試驗用2號兔血清。見表2。

表2 家兔的血清效價（P／N）Tab.2 Serum antibody titer of rabbits（P／N）

2.3 純化多克隆抗體的鑒定

2.3.1 蛋白回收率 硫酸銨鹽析粗純蛋白經(jīng)DEAE-sepharose Fast Flow柱純化后，抗體蛋白回收率為65.6%，見圖3；經(jīng)Protein A柱純化后，抗體蛋白回收率為30.9%，見圖4。純化后的蛋白含量均較純化前低，DEAE-Sepharose Fast Flow的蛋白回收率更高，純化效果優(yōu)于Protein A。

圖3 多克隆抗體的DEAE-Sepharose Fast Flow柱純化圖譜Fig.3 Purification of polyclonal antibody by DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography

圖4 多克隆抗體的ProteinA柱純化圖譜Fig.4 Purification of polyclonal antibody by Protein A chromatography

2.3.2 純度及相對分子質(zhì)量 純化的抗體經(jīng)12%非還原型SDS-PAGE分析顯示，純度大于94%，因含有一定的空間結(jié)構(gòu)，抗體蛋白條帶大小約為200 000，見圖5。

圖5 純化多克隆抗體的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of purified polyclonal antibody

2.3.3 Western blot分析 結(jié)果顯示，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow柱純化后的多克隆抗體可與抗原結(jié)合，其相應(yīng)抗原覆蓋率較高，且與純化前的血清多克隆抗體條帶一致；經(jīng)Protein A柱純化后的多克隆抗體可與部分抗原結(jié)合，與純化前血清相比，其抗原覆蓋率較低。見圖6。表明DEAE-Sepharose Fast Flow柱純化效果優(yōu)于Protein A柱。

圖6 純化多克隆抗體的Western blot分析Fig.6 Western blotting of purified polyclonal antibody

2.4 多克隆抗體的應(yīng)用 Western blot和SDS-PAGE分析顯示，純化初期存在較多的宿主蛋白，經(jīng)多步驟純化后，單價原液中未見殘留蛋白，僅含流感病毒蛋白，見圖7。

圖7 純化樣品殘留蛋白的SDS-PAGE（A，C）及Western blot（B，D）分析Fig.7 Analysis of residual HCPs in purified samples by SDS-PAGE（A，C）and Western blot（B，D）

3 討論

理想的抗原是從生物制品的半成品或成品中獲得所需要的宿主細(xì)胞殘留蛋白，因殘留蛋白在生物制品中含量少，從生物制品中獲得HCP幾乎不可能［12］。一般的替代方法是通過反復(fù)凍融或超聲破碎等獲得宿主細(xì)胞全蛋白替代生物制品中獲得的殘留蛋白［13］。裂解的細(xì)胞蛋白可作為抗原免疫實驗動物制備多克隆抗體，制備的抗體可檢測出生物制品中的殘留蛋白［12］。另外，裂解獲得的宿主細(xì)胞全蛋白制備的殘留蛋白試劑盒不會由于純化等下游工藝的變更而引起檢測的失效，而且該方法還可將不同的細(xì)胞蛋白混合后制備抗原，檢測多種不同細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品的殘留蛋白［13-14］。本實驗采用反復(fù)凍融的方法裂解無血清懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞，制備不含血清、外源因子、胰酶、裂解液等雜質(zhì)的全細(xì)胞蛋白抗原。用此抗原蛋白免疫實驗動物可產(chǎn)生效價高、特異性好的多克隆抗體。Western blot分析表明，MDCK細(xì)胞抗原可與純化后的抗體特異性結(jié)合，表明抗原蛋白均能與抗體特異性結(jié)合，增強了試劑盒的敏感性。

Protein A是在金黃色葡萄球菌中表達(dá)的可與免疫球蛋白結(jié)合的蛋白，其與兔源性抗體結(jié)合力較好，常用于單克隆抗體的純化［15］，若用Protein A純化多克隆抗體，可能僅有部分多克隆抗體與其結(jié)合，純化效果不理想。DEAE-Sepharose Fast Flow為陰離子交換介質(zhì)，可用來純化多克隆抗體，且純化效果優(yōu)于Protein A，因此，可選擇使用陰離子交換柱純化多克隆抗體。陰離子交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow的價格比Protein A低，且可分離多種IgG，純化時的作用條件較溫和，抗體不易失活，可用于純化多克隆抗體［16］。

建立宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測試劑盒的一個關(guān)鍵因素是獲得特異性好、抗原覆蓋率高的多克隆抗體。本研究通過反復(fù)凍融裂解MDCK細(xì)胞獲得全細(xì)胞蛋白，作為抗原免疫實驗動物，制備了含多克隆抗體的血清。該血清經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow純化后獲得特異性好、抗原覆蓋率高的多克隆抗體。該抗體可用于定性分析純化樣品中的宿主細(xì)胞殘留蛋白含量和數(shù)量，從而為純化工藝提供參考。