趙文蘋，王建發(fā)，范春玲

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院黑龍江省牛病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319

乳房炎是全球公認(rèn)的奶牛三大疾病之一，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失位居各類疾病之首，細(xì)菌感染是導(dǎo)致奶牛發(fā)生乳房炎的最重要因素。乳腺上皮細(xì)胞是細(xì)菌感染與乳腺免疫的初始重要交匯處，在該交匯處乳腺上皮細(xì)胞啟動了機(jī)體對病原微生物最早的免疫識別和免疫應(yīng)答，并發(fā)揮協(xié)調(diào)后續(xù)免疫分子、免疫細(xì)胞應(yīng)答的重要作用。乳房炎的致病微生物主要有大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又稱內(nèi)毒素，是大腸埃希菌細(xì)胞壁的主要成分，可激活乳腺上皮細(xì)胞表面的模式識別受體，引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)。外泌體（exosome）是細(xì)胞對外分泌的小囊泡，直徑為40～120 nm的膜包裹結(jié)構(gòu)，可特異性包裹一些蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等物質(zhì)，具有生物活性，能夠被受體細(xì)胞吸收，參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等過程［1］。奶牛乳腺感染大腸埃希菌后，上皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可能以遠(yuǎn)距擴(kuò)散的方式調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞功能，進(jìn)而影響乳腺炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。為明確大腸埃希菌感染對乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生外泌體的影響，本研究對LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞后產(chǎn)生的外泌體進(jìn)行分離鑒定，并與正常培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞外泌體特征進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 奶牛乳腺上皮細(xì)胞系由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心牛病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑 DMEM／F12培養(yǎng)基購自美國Hy-Clone公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液、SDSPAGE凝膠制備試劑盒及BCA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（FBS）購自澳洲CLARK公司；無外泌體血清購自美國SBI公司；鼠抗CD63單克隆抗體購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）及小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自北京碧云天生物技術(shù)公司；小鼠抗HSP70及HSP90單克隆抗體購自美國普洛泰克公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮罐凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，37℃水浴快速融化，轉(zhuǎn)移至離心管中，300×g離心4 min；棄上清，加入完全培養(yǎng)液（10%FBS+1%雙抗），移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，搖勻，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞生長狀態(tài)良好，用PBS洗滌1～2次，加入2 mL 1%胰蛋白酶，37℃消化2～3 min，加入3 mL完全培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移至離心管中，300×g離心4 min；棄上清，加入完全培養(yǎng)液，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，搖勻，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代2～3次，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞分組及處理 待乳腺上皮細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%時，更換為無外泌體血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)70%～90%時，用終濃度為20 μg／mL的LPS與奶牛乳腺上皮細(xì)胞繼續(xù)共孵育6 h；收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，即LPS刺激組。同時以未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)液上清作為對照組。

1.5 外泌體的分離 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清200 mL，分裝于50 mL離心管中，于4℃，2 000×g離心10 min；去除細(xì)胞，4℃，10 000×g離心30 min；去除細(xì)胞碎片，110 000×g離心70 min；去上清，用PBS重懸，110 000 × g離心 70 min；去上清，用 100 μL PBS重懸，即獲得外泌體，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppendorf管中，-80℃保存。

1.6 外泌體的鑒定

1.6.1 形態(tài)學(xué)分析 將鋪有碳支持膜的銅網(wǎng)輝光放電20 s；取各組外泌體樣品20 μL，置銅網(wǎng)上孵育5 min；用濾紙吸干多余液體，于20 μL磷鎢酸染色液中孵育15 s，室溫靜止10 min；待銅網(wǎng)干燥后，透射電子顯微鏡下觀察，拍照。

1.6.2 蛋白濃度 采用BCA法測定各組外泌體樣品的蛋白濃度，進(jìn)行3次獨(dú)立檢測，取平均值。

1.6.3 特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá) 采用Western blot法。各組外泌體分別取30 μg樣品，經(jīng)15%SDSPAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉2 h；用1×TBST緩沖液洗滌2次，每次10 min，加入小鼠抗CD63（1∶500稀釋）、HSP70（1∶1 000稀釋）、HSP90（1 ∶1 000稀釋）及GAPDH（1∶1 000稀釋）單克隆抗體，4℃過夜；用1×TBST緩沖液洗滌2次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG（H+L）（1 ∶1 000稀釋），室溫反應(yīng)1 h；1×TBST緩沖液洗滌2次，每次10 min，ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)情況 奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)3代后，對照細(xì)胞貼壁生長，界限清晰，體積較大，呈典型鋪路石形狀；LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞6 h，細(xì)胞界限模糊，明顯收縮、變圓，細(xì)胞空泡化變性、培養(yǎng)液中有少量漂浮的死亡細(xì)胞。見圖1。

圖1 乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的光鏡觀察（×200）Fig.1 Optical microscopy of morphology of mammary epithelial cells（× 200）

2.2 外泌體的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)分析 LPS刺激組外泌體大小均一，直徑均在40～120 nm之間，外形呈圓形或橢圓形的茶托樣結(jié)構(gòu)，可見明顯膜性結(jié)構(gòu)，形態(tài)無明顯差異；對照組視野下外泌體密度大于LPS刺激組，但對照組含有較多雜蛋白。見圖2。

圖2 外泌體形態(tài)的透射電鏡觀察（×50 000）Fig.2 TEM of morphology of exosomes（× 50 000）

2.2.2 蛋白濃度 對照組及LPS刺激組的奶牛乳腺上皮細(xì)胞上清液中外泌體蛋白濃度均值分別為（2.59± 0.11）和（1.36± 0.14）mg／mL，前者高于后者。

2.2.3 特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá) 經(jīng)LPS刺激獲得的外泌體與小鼠抗CD63、HSP90和HSP70單克隆抗體可發(fā)生特異性結(jié)合，且于相對分子質(zhì)量約45 000、90 000、70 000處可見相應(yīng)的特異性結(jié)合條帶。與對照組比較，LPS刺激組外泌體表面CD63、HSP90和HSP70蛋白表達(dá)量降低。見圖3。

圖3 Western blot法檢測外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blotting of expression of marker proteins in exosomes

3 討論

外泌體作為生物體內(nèi)一類重要囊泡，已成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可在動物體全身廣泛傳遞，改變靶細(xì)胞狀態(tài)［2］。奶牛乳腺組織可分泌外泌體，且乳源外泌體可在人內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并被巨噬細(xì)胞攝取，進(jìn)而調(diào)控其免疫功能［3-6］，涉及的免疫細(xì)胞主要包括T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等［7］。未成熟樹突細(xì)胞來源的外泌體表面的CD55和CD59可增強(qiáng)機(jī)體對凋亡細(xì)胞的清除作用，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)［8］，表明外泌體可通過多種途徑對免疫細(xì)胞的多種功能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。目前，許多研究證實(shí)，奶牛乳腺組織可分泌外泌體，且乳源外泌體可在人內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并被巨噬細(xì)胞攝取，進(jìn)而調(diào)控其免疫功能［7-10］。MUROVA 等［11］用地塞米松、胰島素和催乳素處理體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)液提取的外泌體中miRNA表達(dá)模式發(fā)生了顯著變化，深入研究證實(shí)，外泌體中的miR-148a可能與奶牛泌乳量相關(guān)，進(jìn)而證實(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞可分泌外泌體，且外泌體中包裹物質(zhì)的種類受生理因素調(diào)控。金黃色葡萄球菌感染奶牛后，乳源外泌體中包裹的蛋白質(zhì)、miRNA等成分也隨之發(fā)生了改變［5］。

本研究連續(xù)培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)LPS刺激細(xì)胞分泌獲得外泌體，透射電鏡結(jié)果顯示，提取的外泌體顆粒直徑在40～120 nm之間，均一性良好。CD63、HSP90和HSP70蛋白是外泌體的蛋白標(biāo)志物，CD63是四次跨膜蛋白家族的成員，HSP90和HSP70蛋白是外泌體表面蛋白［12］，這些蛋白可特異性結(jié)合內(nèi)容物并分選入外泌體。Western blot結(jié)果顯示，分離物表達(dá)外泌體表面標(biāo)志物CD63、HSP70和HSP90蛋白，進(jìn)一步證明了電鏡觀察到的囊泡狀物質(zhì)為外泌體。本研究結(jié)果還表明，在相同培養(yǎng)條件下，經(jīng)LPS刺激的乳腺上皮細(xì)胞分泌外泌體的蛋白濃度低于對照組，推測原因可能是由于LPS刺激導(dǎo)致細(xì)胞死亡較多，細(xì)胞總數(shù)減少，外泌體分泌量減少，導(dǎo)致外泌體蛋白濃度下降；另外，LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞使其分泌外泌體能力下降，外泌體產(chǎn)量減少，導(dǎo)致外泌體蛋白濃度下降。對上述推論今后將進(jìn)一步深入研究。本研究為乳源外泌體功能的進(jìn)一步研究及奶牛乳房炎疾病的防控奠定了基礎(chǔ)。