劉計(jì)榮，趙冰，韓化敏

1.華北電力大學(xué)醫(yī)院，北京 102206；2.拜西歐斯（北京）生物技術(shù)有限公司，北京 100070

自然殺傷 T（natural killing T，NKT）細(xì)胞是一群細(xì)胞表面既有T細(xì)胞受體TCR，又有NK細(xì)胞受體的特殊T細(xì)胞亞群［1］。NKT細(xì)胞能表達(dá)T細(xì)胞的TCR及NK細(xì)胞的NKR-P1兩種受體，特別是NKT細(xì)胞多數(shù)表達(dá)Va14 TCR，識(shí)別CD1抗原，而NKR-P1識(shí)別各種糖鏈。絕大多數(shù)NKT細(xì)胞僅能識(shí)別由CD1d分子遞呈的特異性糖脂類分子，而不能識(shí)別由主要組織相容性復(fù)合物（MHC）遞呈的多肽［2］。NKT細(xì)胞表面的TCRαβ鏈，使得NKT細(xì)胞特異性識(shí)別由CD1d分子呈遞的脂類或糖脂類抗原，其中α-GalCer通過(guò)與CD1d特異性結(jié)合，而CD1d又與TCR連接形成三聯(lián)體復(fù)合體，將α-GalCer抗原遞呈給Ⅰ型NKT細(xì)胞，激活的NKT細(xì)胞具有直接殺瘤效應(yīng)，并進(jìn)一步活化NK細(xì)胞，促進(jìn)其殺瘤效應(yīng)；α-GalCer激活的Ⅰ型NKT細(xì)胞可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌IL-12，從而增強(qiáng)抗瘤效應(yīng)；活化后的NKT細(xì)胞能夠快速、大量分泌Th1、Th2型細(xì)胞因子，從而強(qiáng)有力地影響免疫反應(yīng)類型，實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)控。

目前，多項(xiàng)自體NKT細(xì)胞治療腫瘤的臨床試驗(yàn) 已注冊(cè)進(jìn)行（NCT01801801852，NCT02619058，NCT03093688）。張明徽［3］表示，將 NKT 特異性擴(kuò)增后回輸治療，或采用激動(dòng)藥物將患者體內(nèi)的NKT激活，可能會(huì)達(dá)到徹底壓制腫瘤的目標(biāo)。已有早期肝癌和胃癌轉(zhuǎn)移患者僅依靠該項(xiàng)技術(shù)，無(wú)病存活超過(guò)3年。如何在體外獲得足夠量、有活性的NKT細(xì)胞是成功進(jìn)行NKT細(xì)胞過(guò)繼性免疫的關(guān)鍵。但由于NKT細(xì)胞在外周血數(shù)量有限，擴(kuò)增效率低，難以獲得足夠治療劑量的細(xì)胞數(shù)量。已知在NKT細(xì)胞激活過(guò)程中，CD1d和α-GalCer的作用不可代替。α-GalCer作為Ⅰ型NKT細(xì)胞的特異性激動(dòng)劑，可用于在體內(nèi)外活化并大量擴(kuò)增Ⅰ型NKT細(xì)胞。自然情況下，CD1d與β2微球蛋白形成異源二聚體，通過(guò)將表達(dá)CD1d與hIgG1的基因連接，原核或真核表達(dá)重組蛋白，并借助hIgG1自身的二硫鍵形成二聚體，該重組蛋白負(fù)載α-GalCer后可作為誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法。另外，還可利用α-GalCer／CD1d四聚體作為Ⅰ型NKT細(xì)胞的檢測(cè)工具。

本研究構(gòu)建了一種CD1d／hIgG1重組蛋白，該重組蛋白在設(shè)計(jì)上除了可作為人工的抗原提呈細(xì)胞促進(jìn)Ⅰ型NKT細(xì)胞的激活和擴(kuò)增外，還加入了生物素化標(biāo)簽，可與鏈霉親和素磁珠結(jié)合，起到富集Ⅰ型NKT細(xì)胞以及固相刺激的作用。通過(guò)RT-PCR獲得編碼CD1d蛋白和β2微球蛋白的cDNA，添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)及標(biāo)簽后，將目的基因插入至表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入CHO-K1細(xì)胞建立穩(wěn)定表達(dá)CD1d融合蛋白的細(xì)胞系，持續(xù)獲得大量純化重組蛋白，同時(shí)篩選出CD1d融合蛋白和α-GalCer的最佳添加劑量，進(jìn)行NKT細(xì)胞培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 外周血 由年滿18周歲健康志愿者捐獻(xiàn)，常規(guī)項(xiàng)目檢查均正常，所有志愿者均簽署知情同意書。

1.2 質(zhì)粒、細(xì)胞及菌株 pcDNA3.1（-）載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO-K1細(xì)胞）及293T細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)；linker-BriA tag基因質(zhì)粒由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并提供；hIgG1基因質(zhì)粒和大腸埃希菌（E.coli）DH5α 由拜西歐斯（北京）生物技術(shù)有限公司研發(fā)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.3 主要試劑及儀器 Trizol試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；DNA marker、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司；兔抗人CD1d抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BirA生物素蛋白連接酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)AVIDITY公司；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Protien A柱購(gòu)自美國(guó)GE公司；PCR儀購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank-CD1d（No.NM210766）的功能編碼區(qū)序列和載體pcDNA3.1（-）序列的特點(diǎn)，選擇XbaⅠ和BamHⅠ作為限制性內(nèi)切酶，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物。Primer1：5′-gtctagaatg tctcgctccg tggccttagc tgtg-3′；Pimer2 R：5′-ctccgccaga tccgccacct ccgtctcgat cccacttaac tatc-3′；Primer3 R：5′-cgggatccgc cgccacccga gccacctccg ccagatccgc cacctcc-3′；Primer4 F：5′-cgggatccgtcccgcaaaggcttttcc-3′；Primer5 R：5′-gaggatggat cgga-ggtgta gctccc-3′；Primer6 F：5′-ctacacctcc gatccatcct ctagagtc-3′；Primer7 R：5′-cccccaccac ctttacccgg agacagg-3′；Primer8 F：5′-ccgggtaaag gtggtggggg ttcgggc-3′；Primer9 R：5′-ggaagctttt agtgccattc gattttttgt gcttcgaaga tgtcgttgag gcccg-3′。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag的構(gòu)建 分離外周血PBMC，Trizol試劑提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用引物Primer1／Primer2進(jìn)行第一輪擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：94℃30 s，55℃30 s，72 ℃ 75 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min）；以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用引物Primer1／Primer3進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，獲得片段 β2M+（G4S）3；以 cDNA 為模板，利用引物Primer4／Primer5進(jìn)行擴(kuò)增，獲得CD1d基因；以hIgG1基因質(zhì)粒為模板，利用引物Primer6／Primer7進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hIgG1片段；以linker-BriA tag基因質(zhì)粒為模板，利用引物Primer8／Primer9進(jìn)行擴(kuò)增，獲得linker-BriA tag片段；將hIgG1片段與linker-BriA tag片段混合，利用引物Primer6／Primer9進(jìn)行overlap擴(kuò)增，獲得hIgG1+linker-BriA tag；將CD1d基因片段與hIgG1+linker-BriA tag片段混合，利用引物Primer4／Primer9進(jìn)行overlap擴(kuò)增，獲得CD1d+hIgG1+linker-BriA tag；XbaⅠ、HindⅢ酶切pcDNA3.1（-）及 XbaⅠ、BamHⅠ酶切 β2M+（G4S）3，BamHⅠ、HindⅢ酶切 CD1d+hIgG1+linker-BriA tag，將酶切產(chǎn)物 pcDNA3.1（-）、β2M+（G4S）3 與CD1d+hIgG1+linker-BriA tag用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α，涂布含 100 μg／mL氨芐青霉素平板，進(jìn)行克隆篩選，XbaⅠ和BamHⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag，鑒定正確的質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選 將CHO-K1細(xì)胞用含10%FBS的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag，G418篩選轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞株，接種至96孔板，每孔不超過(guò)1個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。收集上清進(jìn)行6%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及Western blot分析。將穩(wěn)定表達(dá)CD1d蛋白的CHO-K1細(xì)胞系擴(kuò)增培養(yǎng)，取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，超濾離心獲得超濾濃縮液（約30 mL），0.45 μm 濾膜過(guò)濾，用 Protien A 柱純化，ELISA法檢測(cè)表達(dá)量。將純化后獲得的CD1d蛋白按照BirA生物素蛋白連接酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白生物素化，同時(shí)進(jìn)行Western blot分析。

1.7 Western blot分析 取樣品經(jīng)8%SDS-PAGE分離，上樣量均為20 μL，預(yù)染蛋白質(zhì)marker上樣量為5 μL。濃縮膠電泳條件為80 V，45 min，分離膠電泳條件為120 V，45 min。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，4～6℃，200 mA約2 h；封閉液（8%脫脂牛奶）37℃封閉2 h或4℃過(guò)夜；PBST洗滌1次，加入CD1d抗體（1∶1 000稀釋）作為一抗，4℃過(guò)夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG（1∶2 000稀釋）作為二抗，脫色搖床室溫振蕩1 h；PBST洗滌3次，每次10 min，DAB試劑避光顯色5～10 min，加入蒸餾水終止反應(yīng)。用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.8 重組 pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag 質(zhì)粒的真核表達(dá) 試驗(yàn)分為3組：pcDNA3.1（-）空載體組、293T 細(xì)胞組、質(zhì)粒 pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag轉(zhuǎn)染組。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行Western blot分析，方法同1.7項(xiàng)。

1.9 hIgG1-BriA tag蛋白對(duì)NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增影響的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取分離的PBMC進(jìn)行NKT細(xì)胞培養(yǎng)，試驗(yàn)分為2組：hIgG1-BriA tag組，在PBMC培養(yǎng)過(guò)程中加入hIgG1-BriA tag蛋白、α-Galcer糖及CD3抗體；對(duì)照組，僅加入CD3抗體。Beckmancyto FLEX流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分析，采用 anti-CD3-FITC、anti-CD56-PE、anti-CD8-APC（ebiosicense）三種熒光通道，同型對(duì)照抗體確定散點(diǎn)門的未知及檢測(cè)電壓，并調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的鑒定 擴(kuò)增產(chǎn)物CD1d-hIgG1-BriA tag經(jīng)8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 862 bp的特異性片段，見圖1。

圖1 CD1d+hIgG1+BriA tag擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of CD1d+hIgG1+BriA tag

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag的鑒定 質(zhì)粒的雙酶切（XbaⅠ／BamHⅠ）產(chǎn)物經(jīng)8%瓊脂糖凝膠電泳分析，pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA 3個(gè)重組質(zhì)粒均分別可見399、800和6 411 bp的特異性條帶，大小與預(yù)期相符，見圖2；質(zhì)粒的雙酶切（HindⅢ／BamHⅠ）產(chǎn)物經(jīng)8%瓊脂糖凝膠電泳分析，pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA 3 個(gè)重組質(zhì)粒均分別可見1 871和5 800 bp的特異性條帶，大小與預(yù)期相符，見圖3。證明3個(gè)重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

圖2 CD1d基因3個(gè)重組質(zhì)粒的雙酶切（XbaⅠ／BamHⅠ）產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Restriction map of three recombinant vectors for CD1d gene（XbaⅠ／BamHⅠ）

圖3 CD1d基因3個(gè)重組質(zhì)粒的雙酶切（HindⅢ／BamHⅠ）產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Restriction map of three recombinant vectors for CD1d gene（HindⅢ／BamHⅠ）

2.3 pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選及鑒定 9號(hào)CHO-K1細(xì)胞株（泳道5）可表達(dá)CD1d融合蛋白，大小與預(yù)期相符，見圖4；培養(yǎng)上清濃縮液經(jīng)Protien A柱純化，純化后CD1d融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小與預(yù)期相符，見圖5；ELISA結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組載體的CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)液上清樣品（編號(hào) 1～10）A280值分別為 0.073、0.098、0.093、0.082、0.090、0.076、0.106、0.088、0.187和0.107），未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)液上清樣品（陰性對(duì)照）A280值為0.130，9號(hào)CHO-K1細(xì)胞株純化后CD1d蛋白樣品（編號(hào)9-1～4）A280值分別為 3.781、3.259、3.519 和3.717，其中，9號(hào)CHOK1細(xì)胞培養(yǎng)液上清A280值最高，經(jīng)純化A280增加約19倍。純化的CD1d融合蛋白先進(jìn)行生物素化，再進(jìn)行Western blot分析，相對(duì)分子質(zhì)量大小與預(yù)期相符，見圖6。表明9號(hào)細(xì)胞株為表達(dá)CD1d蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株。

圖4 質(zhì)粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag轉(zhuǎn)染CHOK1細(xì)胞表達(dá)的CD1d融合蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blotting of CD1d fusion protein expressed in CHO-K1 cells transfected with plasmid pcDNA3.1（-）-CD1dhIgG1-BriA tag

圖5 9號(hào)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清純化后產(chǎn)物的Western blot分析Fig.5 Western blotting of purified protein expressed in clone 9 of transfected cells

圖6 經(jīng)生物素化的純化的CD1d融合蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blotting of purified CD1d fusion protein after biotinylation

2.4 重組CD1d-hIgG1-BriAtag蛋白的鑒定 Western blot分析顯示，該融合蛋白的二聚體大小處可見明顯條帶，見圖7。證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag可在293T細(xì)胞中正確表達(dá)。

圖7 CD1d蛋白表達(dá)水平的Western blot分析Fig.7 Determination of expression level of CD1d protein by Western blot

2.5 CD1d-hIgG1-BriA tag對(duì)NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響 培養(yǎng)第8天，hIgG1-BriA tag組出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖，成團(tuán)簇細(xì)胞出現(xiàn)，見圖8；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與對(duì)照組（2.31%）相比，CD3+CD56+NKT細(xì)胞由培養(yǎng)前的0.30%擴(kuò)增至4.99%，顯著增加，提示CD1d-hIgG1-BriA tag融合蛋白對(duì)NKT細(xì)胞具有刺激作用，見圖9。

圖8 CD1d-hIgG1-BriA tag融合蛋白作用下培養(yǎng)不同天數(shù)的PBMC的顯微鏡觀察（×200）Fig.8 Microscopy of PBMCs cultured for various days after treatment with CD1d-hIgG1-BriA tag（× 200）

圖9 兩組細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間CD3+CD56+NKT流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞的比較Fig.9 Flow cytometry of CD3+CD56+NKT cells cultured for various days in two groups

3 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一。手術(shù)、放療、化療是腫瘤治療的傳統(tǒng)手段［4］，免疫治療目前已成為治療腫瘤的第四種手段，而且是最有效的手段之一。通過(guò)采集患者自身免疫細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增，再回輸至患者體內(nèi)以殺滅癌細(xì)胞、病原體，激活人體免疫能力，從而預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，可在一定程度上解決患者放化療后免疫力差、生活質(zhì)量下降的弊端。細(xì)胞免疫療法在國(guó)際上已逐漸成為治療癌癥的新趨勢(shì)，2011年世界頂級(jí)期刊《自然》發(fā)文提出“免疫治療的時(shí)代已經(jīng)到來(lái)”［5］。

目前用于細(xì)胞免疫治療的主要有高純度樹突狀細(xì)胞DC、CIK、NK細(xì)胞、CD3抗體激活的殺傷細(xì)胞（CD3AK）、嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）和NKT細(xì)胞。NKT細(xì)胞是從人外周血或臍帶血經(jīng)體外分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)刺激后連續(xù)培養(yǎng)獲得，是聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫的橋梁之一［6］。NKT細(xì)胞是不同于T、B淋巴細(xì)胞的第三類淋巴細(xì)胞，能表達(dá)T細(xì)胞的TCR與NK細(xì)胞的NKR-P1兩種受體，特別是NKT細(xì)胞多數(shù)表達(dá)Va14TCR，識(shí)別CD1抗原，而NKR-P1識(shí)別各種糖鏈。NKT細(xì)胞僅能識(shí)別CD1d分子提呈的脂類、蛋白質(zhì)抗原［7］，在這些抗原的刺激下，NKT細(xì)胞不僅是IL-4和IFNγ的強(qiáng)力產(chǎn)生細(xì)胞，同時(shí)參與Th1／Th2分化的抑制，其主要生物學(xué)功能包括免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒作用，可直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，因此在機(jī)體抗腫瘤、早期抗病毒或胞內(nèi)寄生菌感染的免疫應(yīng)答中起重要作用。

NKT細(xì)胞在人體內(nèi)普遍存在，即使在腫瘤患者體內(nèi)也存在具有效應(yīng)作用的NKT細(xì)胞，且NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別不受MHC表型的限制。因此，α-GalCer／CD1d-NKT系統(tǒng)可能成為人腫瘤免疫治療中新的有效方法。

NKT細(xì)胞的激活不僅可直接發(fā)揮抗腫瘤免疫作用、間接激活多種免疫細(xì)胞，還可激活衰竭的CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞，從而快速、持久地增強(qiáng)抗腫瘤活性。因此，NKT細(xì)胞免疫治療是目前對(duì)免疫治療耐藥癌癥患者的一個(gè)良好的選擇［8］。

既往NKT細(xì)胞在臨床抗腫瘤治療中作用的研究主要集中在將NKT細(xì)胞配體α-GalCer用于激活癌癥患者NKT細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用［9-10］，對(duì)于NKT細(xì)胞唯一識(shí)別的遞呈抗原分子CD1d研究較少，因此本研究體外成功重組了刺激NKT細(xì)胞活化的CD1d-hIgG1融合蛋白，并驗(yàn)證在體外用該蛋白刺激NKT細(xì)胞的增殖。由于NKT細(xì)胞比例較低，影響了擴(kuò)增效果，下一步將對(duì)PBMC進(jìn)行NKT細(xì)胞的磁珠分選純化，并將CD1d-hIgG1融合蛋白／鏈霉親和素磁珠作為固相再進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基、細(xì)胞因子、添加物及CD1d-hIgG1融合蛋白用量進(jìn)行優(yōu)化，為NKT細(xì)胞免疫治療提供了一種體外刺激活化免疫細(xì)胞的選擇。