高媛 ，郭敏 ，張敏 ，胡曉玲 ，翟元芳 ，師如意

1.山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，山西 太原 030001；3.山西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，山西 太原 030001；4.山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室，山西 太原 030001

食管癌是一種消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，我國食管癌的主要組織學(xué)類型為食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）。ESCC死亡率居于第六位，發(fā)病率居于第七位，全球約一半的ESCC發(fā)生在中國［1-2］。食管癌早期缺乏特異性癥狀，且缺乏有效的治療手段。臨床數(shù)據(jù)表明，患者5年生存率為15%～20%［3］。S期激酶相關(guān)蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）是E3泛素蛋白連接酶復(fù)合物SCF（Skpl-Cullin-F-box）的底物識別組件，可識別特定的磷酸化底物并介導(dǎo)泛素化和隨后細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的降解［4-6］，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄［7］。在前列腺癌［8］、黑色素瘤［9］和乳腺癌［10］等癌癥中，較高水平的 Skp2與腫瘤轉(zhuǎn)移和較差的生存期有關(guān)［3，7，9，11］，而Skp2的下調(diào)則導(dǎo)致腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移受到抑制［1］。但目前尚無Skp2基因在ESCC中的功能研究，因此闡明其功能具有重要意義。

本研究選取Skp2表達(dá)較高的ESCC細(xì)胞系KYSE150、KYSE180進(jìn)行Skp2-shRNA和陰性對照（negative control，NC）慢病毒的感染，對敲低前后的細(xì)胞進(jìn)行增殖、侵襲、遷移的功能試驗后，采用RT-qPCR法檢測Skp2潛在下游靶基因P53、P300的變化情況。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒 KYSE180和KYSE150細(xì)胞株由山西醫(yī)科大學(xué)食管癌發(fā)病機理及轉(zhuǎn)化研究重點實驗室保存，均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；Skp2-shRNA和NC病毒由上海漢恒生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、DMSO購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；TRIzol試劑及反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；鼠抗人Skp2單克隆抗體、羊抗鼠二抗購自美國Invtriogen公司；內(nèi)參GAPDH抗體購自中國proteintech 60004-1-Ig；MTT購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室及60、20 cm2培養(yǎng)皿購自美國Corning公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；普通PCR儀、熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；雙色紅外激光成像系統(tǒng)購自美國LICO R，odyssey公司。

1.3 穩(wěn)敲Skp2基因細(xì)胞株的建立 將對數(shù)生長期的KYSE180和KYSE150細(xì)胞分別用含0.25%EDTA的胰酶消化后接種至96孔板，5×103個／孔，待細(xì)胞融合度約達(dá)50%時，按MOI=50加入Skp2-shRNA和NC病毒，吸棄原有培養(yǎng)基，利用半體積進(jìn)行感染，4 h后補齊至正常體積；感染后24 h，吸棄含病毒的培養(yǎng)液，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)；感染后 48 h，KYSE180 細(xì)胞更換含 2 μg／mL Puromycin的新鮮培養(yǎng)液，KYSE150細(xì)胞更換含4 μg／mL Puromycin的新鮮培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，篩選完成后進(jìn)行擴大培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。比較細(xì)胞感染Skp2-shRNA慢病毒后，與空白細(xì)胞、NC病毒之間的功能差異及下游潛在靶基因的變化。

1.4 RT-qPCR法 使用TRIzol試劑提取KYSE180和KYSE150細(xì)胞總RNA，按說明書將2 μg總RNA加入20 μL混合體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作按RT-qPCR試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共35個循環(huán)。RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃10 min加熱激發(fā)酶活性；95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)，收集熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用于PCR擴增的寡核苷酸引物序列Skp2正義鏈：5′-CCATCACCCAGCTGAATCTT-3′，反義鏈：5′-CTGGCACGATTCCAAAAACT-3′；GAPDH 正義鏈：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，反義鏈：5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′；P53 正義鏈：5′-AGGTTGGCTCTGACTGTACC-3′，反義鏈：5′-TCTTCTTTGGCTGGGGAGAG-3′；P300 正義鏈：5′-TCGAGCGGAATACTACCACC-3′，反義鏈：5′-CGAGGCATCATCTGGTTTGG-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR結(jié)束后得到擴增曲線和Ct值，基因差異表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法按下式計算。

ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組

1.5 Western blot分析 提取KYSE150和KYSE180細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)上樣量制備樣品，經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；4℃孵育過夜；加入鼠抗人Skp2單克隆抗體（1∶250稀釋），內(nèi)參GAPDH抗體（1∶2 000稀釋）；洗膜，加入羊抗鼠二抗（1∶10 000稀釋），室溫避光孵育2 h；洗膜，利用odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

1.6 細(xì)胞增殖能力的檢測 采用MTT法。將KYSE-180、KYSE150及對應(yīng)的NC序列的慢病毒和敲低Skp2基因的細(xì)胞接種至96孔板中，分別在24、48、72、96、120 h 后加入 20 μL MTT，37 ℃孵育 4 h；吸棄培養(yǎng)基和MTT混合液，加入200 μL DMSO，于490 nm波長處檢測吸光度，利用prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 細(xì)胞遷移能力的檢測 采用Transwell小室試驗。用無血清培養(yǎng)基將空白細(xì)胞、NC細(xì)胞及穩(wěn)定敲低Skp2基因的KYSE150和KYSE180細(xì)胞懸浮，接種至Transwell小室的上室，在小室下方加入含10%FBS的培養(yǎng)基，48 h后吸棄培養(yǎng)基，用棉簽將多余細(xì)胞擦去，用4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照，每個小室隨機選取5個視野，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

1.8 細(xì)胞克隆形成能力的檢測 采用克隆形成試驗。將KYSE180、KYSE150及對應(yīng)的NC序列的慢病毒和敲低Skp2基因的細(xì)胞接種至6孔板中，10 d后吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，統(tǒng)計形成的有效克隆，進(jìn)行比較分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Skp2基因的表達(dá)情況 結(jié)果顯示，感染Skp2-shRNA的細(xì)胞與空白組細(xì)胞和NC組細(xì)胞相比，Skp2基因的表達(dá)在RNA水平和蛋白水平均受到明顯的抑制，見圖1和圖2。

圖1 RT-qPCR法檢測KYSE150細(xì)胞（A）和KYSE-180細(xì)胞（B）中Skp2基因的敲低效率Fig.1 Determination of Skp2 gene knockdown efficiency in KYSE150（A）and KYSE180（B）cells by RT-qPCR

圖2 KYSE150細(xì)胞（A）和KYSE180細(xì)胞（B）中Skp2基因敲低效率的Western blot分析Fig.2 Determination of Skp2 gene knockdown efficiency in KYSE150（A）and KYSE180（B）cells by Western blot

2.2 下調(diào)Skp2基因?qū)SCC細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果顯示，敲低Skp2基因的細(xì)胞與空白組細(xì)胞和NC組細(xì)胞相比，增殖在96 h后開始受到明顯抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（KYSE150細(xì)胞：F96h=3.407，P＜0.05，F(xiàn)120h=4.927，P ＜ 0.01；KYSE180 細(xì)胞：F96h=4.427，P ＜ 0.05，F(xiàn)120h=5.354，P ＜ 0.01），見圖 3。

圖3 Skp2基因敲低對KYSE150細(xì)胞（A）和KYSE180細(xì)胞（B）增殖的抑制作用Fig.3 Inhibition of proliferation of KYSE150（A）and KYSE180（B）cells after knockdown of Skp2 gene

2.3 下調(diào)Skp2基因?qū)SCC細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果顯示，敲低Skp2基因的細(xì)胞與空白組細(xì)胞和NC組細(xì)胞相比，遷移受到明顯抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（KYSE150 細(xì)胞：F=10.235，P ＜ 0.001；KYSE180細(xì)胞：F=9.560，P ＜ 0.001），見圖 4和圖 5。

圖4 Skp2基因敲低后對KYSE150細(xì)胞（A）和KYSE180細(xì)胞（B）遷移的抑制作用Fig.4 Inhibition of migration of KYSE150（A）and KYSE-180（B）cells after knockdown of Skp2 gene

圖5 Skp2基因敲低后對ESCC細(xì)胞遷移作用的顯微鏡觀察（× 40）Fig.5 Microscopy of migration of ESCC cells after knockdown of Skp2 gene（× 40）

2.4 下調(diào)Skp2基因?qū)SCC細(xì)胞的克隆形成能力的影響 結(jié)果顯示，敲低Skp2基因的細(xì)胞與空白組細(xì)胞和NC組細(xì)胞相比，克隆形成能力受到明顯的抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（KYSE150細(xì)胞：F=6.534，P ＜ 0.01；KYSE180 細(xì)胞：F=7.356，P ＜ 0.01），見圖6和圖7。

圖6 Skp2基因敲低后對KYSE150細(xì)胞（A）和KYSE180細(xì)胞（B）克隆形成的抑制作用Fig.6 Inhibition of clone formation of KYSE150（A）and KYSE180（B）cells after knockdown of Skp2 gene

圖7 Skp2基因敲低后對ESCC細(xì)胞克隆形成的顯微鏡觀察Fig.7 Microscopy of clone formation of ESCC cells after knockdown of Skp2 gene

2.5 Skp2下游潛在靶基因P53和P300的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，敲低Skp2基因的細(xì)胞與空白組細(xì)胞和NC組細(xì)胞相比，可明顯增加Skp2下游靶基因P53和P300的表達(dá)。在KYSE150細(xì)胞中敲低Skp2基因后，P53、P300的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為 4.826和4.214，P均 <0.05）；在 KYSE180細(xì)胞中敲低Skp2基因后，P53、P300的表達(dá)差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為4.932和3.212，P均 <0.05）。見圖8。

圖8 Skp2基因敲低后其潛在下游靶基因P53和P300在KYSE150細(xì)胞（A）和KYSE180細(xì)胞（B）中的變化情況Fig.8 Changes in potential downstream target genes P53 and P300 in ESCC cells after knockdown of Skp2 gene

3 討論

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤，病理類型分為ESCC和食管腺癌，我國主要以ESCC為主［1］。目前關(guān)于食管癌的治療主要為手術(shù)切除原發(fā)病灶結(jié)合術(shù)后的放化療，由于局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率，ESCC患者的生存率仍然很低［12-15］。近年來，基因治療在癌癥臨床研究中越來越普遍，基因療法具有許多臨床治療無法比擬的優(yōu)點，包括對晚期癌癥轉(zhuǎn)移的高選擇性和有效性，以及可能實現(xiàn)個性化治療，使其成為癌癥治療的一種有效手段，并可能替代手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法。因此必須準(zhǔn)確識別癌基因或抑癌基因，為患者制定更有效的治療策略。

Skp2是F-BOX家族成員之一，參與泛素化降解、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和衰老的調(diào)控，以及Skp2-SCF復(fù)合體形式的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［10，16］，在SCF復(fù)合物中，Skp2起到底物識別因子的作用。Skp2已被證明是癌基因，與在多種腫瘤中過度表達(dá)有關(guān)，Skp2過表達(dá)可誘導(dǎo)前列腺增生、增生、發(fā)育不良和低分級癌［16-17］。在子宮內(nèi)膜癌中，Skp2通過調(diào)控p27來調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖［7］。ZHANG 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在多種骨肉瘤細(xì)胞中也存在高表達(dá)的現(xiàn)象，在骨肉瘤小鼠模型中，使用Flavokawain A后，Skp2基因表達(dá)下降，骨肉瘤細(xì)胞侵襲及體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移也會被阻斷。LI等［10］研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4是Skp2的重要泛素化底物，Skp2通過PDCD4降解促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和放射耐受，放射治療結(jié)合Skp2靶向輔助治療可提高乳腺癌患者的臨床生存率。KITAGAWA等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中Skp2可通過抑制P300來抑制P53依賴的凋亡。在其他癌癥中也有關(guān)于Skp2促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)報道，但Skp2基因是否在食管癌中也能起到類似的作用，且其機制如何尚未完全明確。

本研究著重探討了Skp2基因在ESCC中的功能。在ESCC細(xì)胞系和永生化的正常食管上皮細(xì)胞系分別檢測了Skp2基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ESCC細(xì)胞系的表達(dá)明顯高于正常食管上皮細(xì)胞。然后選取KYSE150和KYSE180兩個細(xì)胞株轉(zhuǎn)染敲低Skp2基因的慢病毒，對相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)行為及可能的機制進(jìn)行了檢測。細(xì)胞水平試驗顯示，在敲低Skp2基因后，細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成能力均受到明顯抑制。Skp2基因敲低后，其下游可能的潛在靶基因P53、P300的表達(dá)在RNA水平升高。本研究結(jié)果表明，在ESCC中Skp2可通過抑制P53、P300的表達(dá)促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、遷移。提示Skp2有可能成為ESCC一個新的治療靶點。