文朝朝，王晰，魏艷，李文龍，王海龍，郭睿，趙虹，張棟，弓韜，于保鋒

山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001

唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素-15（sialic acid binding Ig like lectin-15，SIGLEC-15）是一種在脊椎動(dòng)物多種組織中均有表達(dá)的Ⅰ型跨膜蛋白。2007年，ANGATA等［1］最先報(bào)道了SIGLEC-15在巨噬細(xì)胞亞群上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可優(yōu)先識(shí)別一種與腫瘤相關(guān)的聚糖結(jié)構(gòu)唾液酸-Tn（sTn）抗原；2013 年，TAKAMIYA等［2］研究發(fā)現(xiàn)，SIGLEC-15還能轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）中增強(qiáng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）分泌的信號(hào)，進(jìn)一步表明巨噬細(xì)胞上的SIGLEC-15可能通過影響TGF-β介導(dǎo)的腫瘤內(nèi)微環(huán)境來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

近年，腫瘤免疫療法的研究較多，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的研發(fā)對(duì)該領(lǐng)域的研究產(chǎn)生了較大影響，其中靶向程序性死亡受體1／程序性死亡受體-配體1（programmed cell death 1／programmed cell deathligand 1，PD-1／PD-L1）的免疫檢查點(diǎn)抑制劑研究成為熱點(diǎn)［3-5］。有研究表明，PD-1／PD-L1抑制劑僅可對(duì)少數(shù)（<40%）實(shí)體瘤發(fā)揮抑制作用［6-8］，且長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活，引起免疫耐受缺失等副作用，因此亟需尋找類似的靶點(diǎn)來優(yōu)化腫瘤免疫療法。2019年，WANG等［9］通過使用基因組規(guī)模的T細(xì)胞活性陣列將SIGLEC-15確定為一種免疫抑制靶點(diǎn)，并證明由于巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，MCSF）的誘導(dǎo)和干擾素 γ（interferon γ，IFNγ）下調(diào)的影響，SIGLEC-15 在人類癌細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)性骨髓細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)廣泛上調(diào)。另外，腫瘤組織對(duì)SIGLEC-15和PD-1的表達(dá)通常不會(huì)同時(shí)發(fā)生，因此這兩個(gè)靶點(diǎn)將在腫瘤的診療領(lǐng)域互為補(bǔ)充。上述研究結(jié)果表明，SIGLEC-15有望成為癌癥免疫療法的潛在目標(biāo)，對(duì)免疫療法的研究發(fā)展具有重要意義。

ANGATA 等［1］研究表明，SIGLEC-15可能擁有兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，包含1個(gè)帶有賴氨酸殘基的跨膜結(jié)構(gòu)域，且其胞質(zhì)部分的結(jié)構(gòu)較短。本研究在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法對(duì)SIGLEC-15的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能、蛋白相互作用等特性進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為其在免疫療法等抗腫瘤研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列 從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／protein／）中搜索獲得人SIGLEC-15蛋白（GenBank登錄號(hào)：AAY40743.1）氨基酸序列信息進(jìn)行后續(xù)預(yù)測(cè)分析。

1.2 SIGLEC-15理化性質(zhì)的分析 應(yīng)用ProtParam軟件（http:／／web.expasy.org／protparam／）分析 SIGLEC-15的基本理化性質(zhì)；Protscale軟件（http:／／web.expasy.org／protscale／）分析親疏水性；SignalP 4.0 Server軟件（http:／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP-4.0／）分析信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)；TMHMM Server v.2.0軟件（http:／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）分析跨膜結(jié)構(gòu)［10］。

1.3 SIGLEC-15組織表達(dá)特異性、亞細(xì)胞定位及不同腫瘤中表達(dá)情況分析 在NCBI中查找SIGLEC-15在人類正常組織中的表達(dá)情況，并對(duì)其在正常組織和腫瘤組織中的每百萬堿基轉(zhuǎn)錄數(shù)（transcripts per million，TPM）進(jìn)行分析；應(yīng)用 PSORT Ⅱ軟件（https:／／psort.hgc.jp／form2.html）預(yù)測(cè) SIGLEC-15的亞細(xì)胞定位情況；在美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的癌癥基因組圖譜（https:／／www.cancer.gov／about-nci／organization／ccg／research／structural-genomics／tcga，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中查找SIGLEC-15在不同腫瘤中的表達(dá)情況。

1.4 SIGLEC-15的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用SOPMA 軟件（https:／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析二級(jí)結(jié)構(gòu)及不同類型結(jié)構(gòu)域的占比；通過NCBI的Conserved Domain 數(shù)據(jù)庫(kù)（https:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／cdd）分析保守結(jié)構(gòu)域；SWISS-MODEL軟件（https:／／swissmodel.expasy.org／）預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 SIGLEC-15翻譯后位點(diǎn)修飾的預(yù)測(cè) 應(yīng)用NetNGlyc 1.0 軟件 Sever（http:／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）及 NetOGlyc 4.0 軟件 Server（http:／／www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／）預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)；Netphos 3.1軟件Server（http:／／www.cbs.dtu.dk／se-rvices／NetPhos／）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)［11］。

1.6 SIGLEC-15相關(guān)蛋白互作關(guān)系預(yù)測(cè) 應(yīng)用STRING軟件（http:／／string-db.org／）建立與 SIGLEC-15相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置高置信度（0.700），且蛋白個(gè)數(shù)不超過10進(jìn)行分析，并查找SIGLEC-15及其互作蛋白在GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)信息。

1.7 SIGLEC-15系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 在GenBank（http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／sites／entrez?db=nucleotide）中搜索不同物種的SIGLEC-15的氨基酸序列，應(yīng)用ClustalX 2.0軟件對(duì)得到的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，同時(shí)應(yīng)用MEGA-Ⅹ軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，并進(jìn)行分析［12］。

2 結(jié)果

2.1 SIGLEC-15的理化性質(zhì)

2.1.1 基本理化性質(zhì) SIGLEC-15基因位于人類第18號(hào)染色體（18q12.3），含有6個(gè)外顯子，其蛋白由328個(gè)氨基酸殘基組成。該蛋白分子式為C1566H2473N475O455S12，分子量為35 619.49 Da。SIGLEC-15由20種氨基酸組成，其中丙氨酸（Ala）殘基44個(gè)，含量最高，占氨基酸總數(shù)的13.4%；賴氨酸（Lys）殘基3個(gè)，含量最低，占氨基酸殘基總數(shù)的0.9%。見圖1。SIGLEC-15的理論等電點(diǎn)為8.86，氨基酸序列中帶正電荷的殘基（Arg+Lys）34個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）29個(gè)，該蛋白屬堿性蛋白質(zhì)。SIGLEC-15在哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為48.24，判定為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為83.72，親水性平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.217。

圖1 SIGLEC-15的氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition of SIGLEC-15

2.1.2 親水性 SIGLEC-15序列第155位谷氨酸（Glu）親水性得分最高，為-2.767，第279位亮氨酸（Leu）和280位的甘氨酸（Gly）疏水性得分最高，均為2.933。SIGLEC-15的親水氨基酸區(qū)域明顯多于疏水氨基酸區(qū)域，綜合考慮其GRAVY為-0.217，因此判定該蛋白為親水性蛋白。見圖2。

圖2 SIGLEC-15的親疏水性分析Fig.2 Analysis of hydrophobicity of SIGLEC-15

2.1.3 信號(hào)肽結(jié)構(gòu) SIGLEC-15的氨基酸序列第20位處C值與Y值達(dá)最大，分別為0.221和0.435，S值平均值（1～19位）為0.848（>0.5時(shí)判定蛋白質(zhì)為分泌蛋白），因此預(yù)測(cè)SIGLEC-15含有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。見圖3。

圖3 SIGLEC-15信號(hào)肽的分析Fig.3 Analysis of signal peptide of SIGLEC-15

2.1.4 跨膜結(jié)構(gòu) SIGLEC-15蛋白序列的1～260位氨基酸殘基位于膜外，共260個(gè)；284～328位氨基酸殘基位于膜內(nèi)，共45個(gè)；跨膜結(jié)構(gòu)為261～283位氨基酸殘基，共23個(gè)。因此判定SIGLEC-15共有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。見圖4。

圖4 SIGLEC-15跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of transmembrane structure of SIGLEC-15

2.2 SIGLEC-15的組織表達(dá)特異性、亞細(xì)胞定位及在不同腫瘤中表達(dá)情況

2.2.1 組織表達(dá)特異性 SIGLEC-15在小腸中的表達(dá)水平最高，RPKM約為1.785；在心臟中的表達(dá)水平最低，RPKM約為0.001。SIGLEC-15在正常組織中的 TPM：血液 57、骨 41、脾臟 37、血管 19、皮膚14、乳腺 13、淋巴結(jié) 11；在腫瘤組織中的 TPM：軟骨肉瘤36、神經(jīng)膠質(zhì)瘤27、皮膚腫瘤23、乳腺腫瘤21、淋巴瘤13、胰腺腫瘤9。另外，SIGLEC-15在新生兒體內(nèi)的表達(dá)量高于成人，約為成人體內(nèi)表達(dá)量的56倍。

2.2.2 亞細(xì)胞定位 SIGLEC-15定位在細(xì)胞外的概率最大，為34.80%，其次分別為細(xì)胞膜（30.40%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（21.70%）和高爾基體（13.00%）。

2.2.3 在不同腫瘤中的表達(dá) 14項(xiàng)研究的51個(gè)SIGLEC-15不同位點(diǎn)突變的51例癌癥病例中，子宮內(nèi)膜癌所占比例最大，乳腺浸潤(rùn)性癌所占比例最小，見圖5。另外，數(shù)據(jù)庫(kù)中所收錄的553個(gè)病例中，由SIGLEC-15突變引起的腫瘤原發(fā)位點(diǎn)（primary site）共32個(gè)，其中原發(fā)于卵巢的病例最多，達(dá)111例，占病例總數(shù)的20%，見圖6。由SIGLEC-15突變引起腫瘤的患者中女性多于男性，且患者均為23歲以上。

圖5 SIGLEC-15突變引起的癌癥分布Fig.5 Distribution of cancer caused by SIGLEC-15 mutation

圖6 SIGLEC-15突變引發(fā)腫瘤的原發(fā)部位病例分布Fig.6 Case distribution of primary site of tumor induced by SIGLEC-15 mutation

2.3 SIGLEC-15的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3.1 二級(jí)結(jié)構(gòu) SIGLEC-15蛋白由5.49%的β-轉(zhuǎn)角、21.34%的α-螺旋、23.78%的延長(zhǎng)鏈及49.39%的無規(guī)卷曲構(gòu)成，無規(guī)卷曲所占比例最大，占其序列全長(zhǎng)近一半的長(zhǎng)度，見圖7。

圖7 SIGLEC-15的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of secondary structure of SIGLEC-15

2.3.2 保守結(jié)構(gòu)域 SIGLEC-15共有兩個(gè)免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，分別為47～165位及187～251位，見圖8。

圖8 SIGLEC-15的保守結(jié)構(gòu)域Fig.8 Conserved domain of SIGLEC-15

2.3.3 三級(jí)結(jié)構(gòu) SIGLEC-15可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型共8種，選擇其中擬合度最高進(jìn)行分析。該預(yù)測(cè)結(jié)果的GMQE為0.39，OMEAN為-3.64，序列相似度22.82%，模型中所示二級(jí)結(jié)構(gòu)及所占比例與2.3.2項(xiàng)結(jié)果基本相符。SIGLEC-15的無規(guī)卷曲所占比例較大，因此其三級(jí)結(jié)構(gòu)彈性較大，見圖9。

圖9 SIGLEC-15的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of tertiary structure of SIGLEC-15

2.4 SIGLEC-15翻譯后位點(diǎn)修飾的預(yù)測(cè) SIGLEC-15蛋白共有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別位于172和312位；共有1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，位于207位。SIGLEC-15有8個(gè)位點(diǎn)可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（以得分>0.8 計(jì)）：53 位 Ser（0.872）、126 位 Ser（0.949）、156位Ser（0.844）、213位Ser（0.991）、235位Tyr（0.861）、299 位 Thr（0.946）、308 位 Ser（0.987）、310 位 Ser（0.970）。

2.5 SIGLEC-15相關(guān)蛋白互作關(guān)系的預(yù)測(cè) 與SIGLEC-15有物理或化學(xué)相互作用及間接作用的蛋白共4個(gè)，分別為 TYROBP（score：0.954）、CD22（即 SIGLEC-2，score：0.835）、SIGLEC-1（score：0.824）、MAG（score：0.750），所得蛋白與SIGLEC-15構(gòu)成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖10。SIGLEC-15和SIGLEC-1涉及到的生物過程有破骨細(xì)胞發(fā)育調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控以及防御應(yīng)答，CD22 只涉及細(xì)胞黏附。SIGLEC-1、CD22、MAG均有碳水化合物結(jié)合功能，均參與細(xì)胞黏附分子通路。見表1

表1 GO生物過程分析Tab.1 GO biological process analysis

圖10 SIGLEC-15蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.10 Protein interaction network of SIGLEC-15

2.6 SIGLEC-15的系統(tǒng)進(jìn)化樹 在GenBank中下載得到人類、猩猩、馬、牛、小鼠、壁虎、蝙蝠、家犬、旱獺、青鳉魚等22個(gè)物種的SIGLEC-15氨基酸序列。MEGA-Ⅹ構(gòu)建進(jìn)化樹見圖11，人類SIGLEC-15與猩猩、白狨猴等靈長(zhǎng)類動(dòng)物SIGLEC-15的同源性最高。SIGLEC家族的其他亞型僅存在于哺乳動(dòng)物中，而SIGLEC-15不僅存在于哺乳動(dòng)物中，還存在于脊椎動(dòng)物的其他分支中，表明SIGLEC-15在脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中是相對(duì)保守的。

圖11 22個(gè)物種的SIGLEC-15進(jìn)化樹Fig.11 Phylogenetic tree of SIGLEC-15 of 22 species

3 討論

本研究應(yīng)用各種生物信息學(xué)工具對(duì)一種新型腫瘤免疫抑制靶點(diǎn)SIGLEC-15的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能、蛋白互作等進(jìn)行了系統(tǒng)的預(yù)測(cè)分析。分析結(jié)果得出，SGLEC-15是一種堿性不穩(wěn)定蛋白，親水性較強(qiáng)，是具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的分泌蛋白。該蛋白具有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種膜蛋白。有研究表明，SIGLEC-15為主要表達(dá)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表面的跨膜蛋白［1-3］，但本實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SIGLEC-15可能存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，可能在胞外有所分布，因此該蛋白是否確實(shí)具有分泌能力，是否能在胞外環(huán)境發(fā)揮特殊功能，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞內(nèi)翻譯合成后，需進(jìn)一步翻譯修飾才能具有生物學(xué)功能，因此對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后位點(diǎn)修飾的預(yù)測(cè)較重要。蛋白質(zhì)的功能可通過糖基化作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，是蛋白質(zhì)修飾的重要手段，主要包括以天冬酰胺、N-末端氨基酸及賴氨酸或精氨酸為連接點(diǎn)的N-糖基化修飾，以蘇氨酸、絲氨酸、羥脯氨酸和羥賴氨酸的羥基為連接點(diǎn)的O-糖基化修飾及糖肽鍵的糖基化等修飾形式。另外，蛋白磷酸化是蛋白在激酶的作用下被激活而發(fā)揮生物學(xué)功能的翻譯后修飾形式，同樣對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，SIGLEC-15可能具有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)及8個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)，該結(jié)論對(duì)SIGLEC-15作為新型腫瘤免疫抑制靶點(diǎn)的研究具有重要意義。WANG等［9］研究已表明，SIGLEC-15在腫瘤中的高表達(dá)會(huì)持續(xù)抑制T細(xì)胞的活性，敲除或抑制SIGLEC-15可提高小鼠的抗腫瘤能力。本實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)到上述翻譯后修飾位點(diǎn)分散于SIGLEC-15的不同位置，結(jié)合親疏水性及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果，可設(shè)計(jì)不同的藥物模型對(duì)SIGLEC-15進(jìn)行抑制，為SIGLEC-15抑制劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

與SIGLEC-15有相互作用的4個(gè)蛋白中，SIGLEC-1、CD22、MAG均有碳水化合物結(jié)合功能，均參與細(xì)胞黏附分子通路，SIGLEC-15和TYROBP（也稱DNAX 12 kDa活化蛋白，DAP12）在報(bào)告中均未得出相關(guān)結(jié)論，但 ORNH?FFT 等［13］報(bào)道表明，SIGLEC-15具有順式結(jié)合碳水化合物的結(jié)構(gòu)。SIGLEC-15與TYROBP的相互作用更為密切，兩者共同參與免疫應(yīng)答反應(yīng)及細(xì)胞發(fā)育尤其是破骨細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控。TYROBP含有免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），該結(jié)構(gòu)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，ITAM的磷酸化可迅速募集多種游離蛋白與銜接蛋白，進(jìn)而傳遞細(xì)胞信號(hào)。ANGATA等［1］指出，TYROBP磷酸化的ITAM結(jié)構(gòu)可與巨噬細(xì)胞上SIGLEC-15跨膜結(jié)構(gòu)中的賴氨酸通過電荷依賴性機(jī)制相互作用，進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)，但這與腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的SIGLEC-15產(chǎn)生的作用是相反的。WANG等［9］體外實(shí)驗(yàn)表明，敲除小鼠體內(nèi)的SIGLEC-15基因后，并未引起小鼠自身免疫疾病的發(fā)生，雖尚無相關(guān)報(bào)道闡述其原因，但其證明了SIGLEC-15將是一個(gè)具有潛力的免疫抑制靶點(diǎn)。另外，SIGLEC-15互作蛋白的GO分析顯示SIGLEC-15與破骨細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，該蛋白在骨組織發(fā)育旺盛的新生兒及青少年體內(nèi)的表達(dá)量比成人高得多，但TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)存的SIGLEC-15突變引起的癌癥案例中，并無新生兒、兒童或青少年，因此推測(cè)SIGLEC-15基因在未成年人體內(nèi)的突變率較低。

目前，雖然對(duì) SIGLEC 家族，如 SIGLEC-2（CD22）、SIGLEC-3（CD33）等的研究已較深入，但SIGLEC-15在腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)中作用的報(bào)道較少。目前，SIGLEC-15被認(rèn)為是PD-1的補(bǔ)充靶點(diǎn)，其抗體的研發(fā)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，相關(guān)的研究也越發(fā)受到人們的關(guān)注，SIGLEC-15的研究有望在腫瘤免疫療法的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。