唐志凌，趙明明，陳靖潼，高璐瑤，陳文學(xué)，李遠(yuǎn)頌

(1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，?？?570228；2.海南大學(xué) 研究生處，海口 570228)

草果(Amomumtsao-ko)為姜科豆蔻屬多年生草本植物，主產(chǎn)于我國(guó)的云南、廣西、貴州等地[1]。草果具有特殊辛香味，并能去除腥味，現(xiàn)今多將草果用于烹調(diào)肉類食品，是日常生活中必備的調(diào)味香料，被人們譽(yù)為食品調(diào)味中的“五香之一”[2]。研究表明，在草果中檢測(cè)出痕量硒，適當(dāng)補(bǔ)硒有益人體健康，因此經(jīng)常食用草果對(duì)人體有一定的營(yíng)養(yǎng)保健功效[3]。同時(shí)草果也是我國(guó)一種傳統(tǒng)的中藥材，可改善瘧疾、咳嗽、積食等癥狀[4]。草果揮發(fā)油有較好的抗氧化性，對(duì)于清除羥自由基和超氧陰離子自由基有著十分顯著的效果[5-6]。此外，草果提取物還具有抑菌效果，Cui Qi等[7]研究表明草果提取物具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性；謝小梅等[8]通過(guò)對(duì)草果揮發(fā)油的深入研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)產(chǎn)黃青霉、黑曲霉等真菌具有良好的殺菌效果。

由于微生物活動(dòng)和氧化等作用，肉制品很容易腐敗變質(zhì)。目前，為了防止肉制品的腐敗變質(zhì)，保持其新鮮度，常常在其中添加化學(xué)防腐劑，但長(zhǎng)時(shí)間研究表明，有些化學(xué)防腐劑具有誘癌性、致畸性、低毒性以及某些潛在的危害[9]。天然防腐劑因安全、高效等優(yōu)點(diǎn)在食品行業(yè)受到廣泛關(guān)注。從植物中提取有效成分抑菌防腐已成為研究的熱點(diǎn)，而香辛料是其主要來(lái)源之一。食源大腸桿菌(Escherichiacoli)與沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)是食品安全領(lǐng)域中最常見(jiàn)的致病菌[10]，草果多用于肉制品的調(diào)味。本研究在對(duì)草果抑菌物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并初步探討其抑菌活性的基礎(chǔ)上[11]，進(jìn)一步探索草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌機(jī)理，為草果提取物應(yīng)用于肉制品的防腐保鮮提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)：海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、丙酮：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AR124N型電子天平；SPX-288智能型生化培養(yǎng)箱；XB-HP型中藥粉碎機(jī)；SHA-2型水浴全溫振蕩器；GGT7型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；GI54DS型高壓滅菌鍋；SW-CJ-1FD 型無(wú)菌超凈工作臺(tái)；Christ Alphal型細(xì)胞冷凍干燥機(jī)；S-3000型掃描式電子顯微鏡；TU1810 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；CR22N型落地式高速冷凍離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 草果抑菌活性物質(zhì)的提取

草果的產(chǎn)地和提取方法使得提取物的成分組成產(chǎn)生差異[12]。本實(shí)驗(yàn)參考彭美芳等[13]的提取方法，將草果粉浸泡、超聲后得到草果粗提物，然后采用乙酸乙酯萃取法，得到抑菌效果最佳的草果乙酸乙酯萃取物。

1.3.2 菌種活化

將大腸桿菌、沙門氏菌在培養(yǎng)基中傳代活化后，培養(yǎng)18～24 h，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度為106～107CFU/mL待用[14]。

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

采用肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度。抑制液的配制采用二倍梯度稀釋法[15]，制成終濃度分別為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125 mg/mL的含藥培養(yǎng)基。將供試菌接種至含藥培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)置空白組。倒置培養(yǎng)24 h后，觀察。以完全不長(zhǎng)菌的最小稀釋濃度確定為草果萃取物對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌作用的MIC。參考潘旭遲等[16]的方法，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，以完全不長(zhǎng)菌的最小稀釋濃度確定為草果萃取物對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌作用的MBC。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線[17]。將供試菌接種至液體培養(yǎng)基中，加入抑菌物質(zhì)，調(diào)至各自最小抑菌濃度，同時(shí)設(shè)置空白組和陰性對(duì)照組。恒溫培養(yǎng)24 h，每2 h取樣，測(cè)定樣品在600 nm下的OD值。以時(shí)間和OD值為橫、縱坐標(biāo)繪制對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 細(xì)胞形態(tài)的觀察

采用掃描電鏡法觀察兩種細(xì)胞微觀形態(tài)的變化。在培養(yǎng)至各自對(duì)數(shù)期的菌懸液中加入終濃度為1×MIC的草果提取物, 并設(shè)置空白組和陰性對(duì)照組。放置于最適溫度，在180 r/min搖床中培養(yǎng), 分別取培養(yǎng)至4，8 h的菌懸液, 低溫離心10 min后，各自收集菌體。再依次使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.2)和乙醇溶液梯度洗脫3次。最后通過(guò)細(xì)胞凍干機(jī)低溫凍干后取樣鍍金, 在電子顯微鏡上放大8000倍觀察細(xì)胞微觀形態(tài)。

1.3.6 堿性磷酸酶(AKP)的測(cè)定

將供試菌分別接種至液體培養(yǎng)基中，加入草果提取物，調(diào)至各自最小抑菌濃度，同時(shí)設(shè)置空白組和陰性對(duì)照組。在水浴振蕩器培養(yǎng)8 h，每隔2 h取樣，按照AKP試劑盒的要求測(cè)定不同樣品在520 nm波長(zhǎng)下的OD值，并計(jì)算出對(duì)應(yīng)的AKP活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的MIC和MBC

由表1可知，草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均有較好的抑菌效果，且抑菌效果隨草果提取物濃度的上升而增強(qiáng)。當(dāng)草果提取物濃度為0.625 mg/mL時(shí)，大腸桿菌難以生長(zhǎng)；當(dāng)草果提取物濃度為1.25 mg/mL時(shí)，沙門氏菌無(wú)法生長(zhǎng)，表明草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，且丙酮對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng)在此次實(shí)驗(yàn)條件下影響較小。另外，草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小殺菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，與其各自最小抑菌濃度相同。說(shuō)明草果提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用較為明顯，且這種抑制作用在短時(shí)間內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

表1 大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng)情況Table 1 The growth situations of Escherichia coli and Salmonella typhimurium

2.2 草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌生長(zhǎng)的影響

草果提取物分別作用大腸桿菌和沙門氏菌24 h，研究其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 草果提取物對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of Amomum tsao-ko extracts on the growth of Escherichia coli

由圖1可知，添加水和丙酮組的細(xì)菌生長(zhǎng)呈現(xiàn)出明顯的S形曲線，并OD值分別在14 h和24 h時(shí)達(dá)到1.287和1.118。丙酮組細(xì)菌生長(zhǎng)較慢于空白組，但對(duì)于細(xì)菌最終生長(zhǎng)結(jié)果并無(wú)顯著影響，因此可說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中丙酮對(duì)于大腸桿菌的影響較小。添加終濃度為1×MIC草果提取物的實(shí)驗(yàn)組，在4～16 h內(nèi)生長(zhǎng)較為緩慢，OD值無(wú)明顯上升；在16～24 h期間OD值略有上浮，但幅度較小，隨后趨向平穩(wěn)狀態(tài)，最終OD值僅達(dá)到0.408，并顯著低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入終濃度為1×MIC的草果提取物能夠有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。

由圖2可知，添加水和丙酮組的沙門氏菌生長(zhǎng)狀態(tài)同大腸桿菌相似，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中丙酮對(duì)沙門氏菌的影響較小。相比于大腸桿菌，沙門氏菌添加終濃度為1×MIC草果提取物的實(shí)驗(yàn)組在數(shù)值上較高，在6～18 h內(nèi)生長(zhǎng)較為緩慢；在18～24 h期間OD值略有上升，達(dá)到0.686。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，終濃度為1×MIC的草果提取物同樣對(duì)沙門氏菌的生長(zhǎng)有著良好的抑制效果，但對(duì)大腸桿菌的抑菌效果更好。

圖2 草果提取物對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of Amomum tsao-ko extracts on the growth of Salmonella typhimurium

2.3 草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響

水、丙酮和草果提取物分別作用大腸桿菌、沙門氏菌4 h和8 h后，觀察電子顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化，掃描電鏡圖見(jiàn)圖3(大腸桿菌)和圖4(沙門氏菌)。

圖3 大腸桿菌的掃描電鏡圖(8000×)Fig.3 The scanning electron microscopy of Escherichia coli注：A1為空白組(4 h)；A2為空白組(8 h)；B1為丙酮組(4 h)；B2為丙酮組(8 h)；C1為實(shí)驗(yàn)組(4 h)；C2為實(shí)驗(yàn)組(8 h)。

圖4 沙門氏菌的掃描電鏡圖(8000×)Fig.4 The scanning electron microscopy of Salmonella typhimurium注：D1為空白組(4 h)；D2為空白組(8 h)；E1為丙酮組(4 h)；E2為丙酮組(8 h)；F1為實(shí)驗(yàn)組(4 h)；F2為實(shí)驗(yàn)組(8 h)。

由圖3和圖4可知，掃描電鏡下，空白組(A1、A2；D1、D2)的大腸桿菌和沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)完整，菌體飽滿，表面較為光滑，細(xì)胞無(wú)明顯破損且無(wú)內(nèi)容物外泄現(xiàn)象。丙酮組(B1、B2；E1、E2)的大腸桿菌和沙門氏菌培養(yǎng)4 h后，細(xì)菌形態(tài)完整，細(xì)胞邊界較為清晰；培養(yǎng)8 h后，大腸桿菌出現(xiàn)局部黏連，但多數(shù)細(xì)胞仍能保持完整形態(tài)，無(wú)明顯破損，表面光滑；而沙門氏菌經(jīng)丙酮組處理8 h與處理4 h無(wú)顯著差異，細(xì)菌形態(tài)并未產(chǎn)生異常變化。實(shí)驗(yàn)組(C1、C2)的大腸桿菌在草果提取物處理4 h后，細(xì)菌形態(tài)與空白組和丙酮組無(wú)顯著差異；而在處理8 h后，細(xì)菌細(xì)胞出現(xiàn)大面積黏連和破損，菌體收縮，表面粗糙，細(xì)胞邊界模糊，部分細(xì)胞呈現(xiàn)嚴(yán)重破裂，造成細(xì)胞內(nèi)容物外泄，而較為黏稠的細(xì)胞內(nèi)容物使得細(xì)胞的黏連和重疊現(xiàn)象嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)組(F1、F2)的沙門氏菌在經(jīng)草果提取物處理4 h后，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，絕大多數(shù)細(xì)胞仍呈現(xiàn)出完整且光滑的細(xì)菌表面；在處理8 h后，沙門氏菌與大腸桿菌表現(xiàn)相似，也出現(xiàn)菌體黏連和斷裂現(xiàn)象，細(xì)菌菌體呈現(xiàn)不同程度的扭曲，表面粗糙，細(xì)胞邊界不明顯。部分細(xì)菌破裂成塊狀，外泄的細(xì)胞內(nèi)容物導(dǎo)致其與其他破裂的細(xì)菌黏合在一起，呈現(xiàn)大面積的細(xì)菌體堆疊。由大腸桿菌和沙門氏菌所得結(jié)果可知，1×MIC的草果提取物在處理大腸桿菌和沙門氏菌8 h后，能夠顯著破壞這兩種細(xì)菌細(xì)胞的正常形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞受到破壞且使得細(xì)胞內(nèi)容物外泄。

2.4 草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌AKP活力的影響

水、丙酮和草果提取物連續(xù)作用大腸桿菌8 h，檢測(cè)胞外AKP含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 大腸桿菌的胞外AKP含量Fig.5 The extracellular AKP content of Escherichia coli

AKP酶存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，正常情況下，當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞壁完整未受到損傷時(shí)，AKP酶不會(huì)泄露到環(huán)境中去。因此，檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境的AKP酶含量可以間接表明細(xì)胞壁是否受到損傷[18]。由圖5可知，空白組和丙酮組的胞外AKP酶含量隨著時(shí)間的推移增長(zhǎng)緩慢。而添加了1×MIC草果提取物的大腸桿菌實(shí)驗(yàn)組，其胞外AKP酶的含量隨時(shí)間的增長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì)，且在各時(shí)間點(diǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組的AKP含量。在6～8 h時(shí)，胞外AKP含量迅速增加，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞壁已經(jīng)受到了損傷，細(xì)胞壁的完整度被破壞。結(jié)合大腸桿菌掃描電鏡圖分析，草果提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的改變主要從6～8 h開(kāi)始?？赡苁谴蠓肿游镔|(zhì)穿過(guò)細(xì)胞壁，使得細(xì)胞壁形成孔洞，最終演變成塌陷，細(xì)菌細(xì)胞逐漸萎縮[19]。

水、丙酮和草果提取物連續(xù)作用沙門氏菌8 h，檢測(cè)胞外AKP含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 沙門氏菌的胞外AKP含量Fig.6 The extracellular AKP content of Salmonella typhimurium

由圖6同樣可以明顯觀察到添加了草果提取物的實(shí)驗(yàn)組在6～8 h內(nèi)上升幅度最大。但與大腸桿菌整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)不同的是，沙門氏菌在實(shí)驗(yàn)的前4 h內(nèi)，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組、空白組還是丙酮組，3組的胞外AKP酶含量基本保持不變。而從4 h開(kāi)始，添加了草果提取物的實(shí)驗(yàn)組，其胞外AKP酶含量開(kāi)始顯著升高。說(shuō)明終濃度為1×MIC的草果提取物對(duì)沙門氏菌細(xì)胞壁的破壞作用主要發(fā)生在4 h之后，且效果顯著。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞層面上進(jìn)行研究，初步探究了草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌兩種常見(jiàn)致病菌的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制作用，其最小抑菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，且最小殺菌濃度也均為0.625，1.25 mg/mL。草果提取物能夠使大腸桿菌和沙門氏菌的細(xì)胞形態(tài)遭到破壞，細(xì)胞壁的通透性增加，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。

草果提取物既可加強(qiáng)肉制品的風(fēng)味，又有顯著的抑菌效果，在未來(lái)開(kāi)發(fā)天然防腐劑等方面具有巨大的潛力。本實(shí)驗(yàn)已初步探索了草果提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌這兩種食品中常見(jiàn)致病菌的抑菌機(jī)理，表明草果提取物在食品加工防腐等方面應(yīng)用價(jià)值較大。當(dāng)前，對(duì)草果提取物抑菌機(jī)制的研究尚不充分，未來(lái)期望進(jìn)一步探明草果提取物對(duì)不同致病菌的抑菌活性和抑菌機(jī)理，并擴(kuò)大草果提取物在食品貯藏和加工領(lǐng)域的使用范圍。