黃俊僮，陳永麗，藍(lán)緒悅，白松，姚開，賈冬英*

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065；2.四川大學(xué) 瀘州產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 瀘州 646000)

洋蔥(AlliumcepaL.)，又名蔥頭、玉蔥、洋蒜等，因其鮮明的揮發(fā)性特征風(fēng)味和極高的營養(yǎng)價值，被譽為“蔬菜皇后”，受到消費者的喜愛[1]。洋蔥的特征風(fēng)味主要源于其含硫化合物，當(dāng)洋蔥經(jīng)過切分、搗碎等處理后，洋蔥細(xì)胞液泡中的蒜氨酸酶得以釋放，迅速催化風(fēng)味前體S-烷基-L-半胱氨酸亞砜(ACSOs)發(fā)生酶促反應(yīng)，生成次磺酸、丙酮酸和氨。其中，次磺酸極易自發(fā)聚合，形成蒜素類物質(zhì)硫代亞磺酸酯(thiosulfinate, TS)，隨后TS發(fā)生降解重排，生成多種揮發(fā)性硫化物，從而形成洋蔥的特有風(fēng)味[2]。

鹽漬是我國生鮮蔬菜傳統(tǒng)的加工方式，既能延長食品貯藏期，也具有增強蔬菜風(fēng)味、激活果蔬內(nèi)源酶活性等作用[3]。Cheng等[4]報道了新鮮洋蔥、自然發(fā)酵洋蔥和加鹽發(fā)酵洋蔥的主要揮發(fā)性硫化物分別占總揮發(fā)物的24%、1.85%和17.51%，指出加鹽發(fā)酵洋蔥的揮發(fā)性硫化物損失較小，并且加鹽發(fā)酵后洋蔥中酯類物質(zhì)含量增加，此發(fā)酵方法既保留了洋蔥的特有香味，又增添了甜味和果香味，同時減少了洋蔥的刺激性氣味。因此，在發(fā)酵過程中添加食鹽有利于洋蔥特征風(fēng)味的保持。然而，目前有關(guān)鹽漬對新鮮洋蔥風(fēng)味物質(zhì)的影響及其作用機制卻鮮有報道。基于此，本文研究了食鹽濃度、鹽漬溫度和時間對洋蔥揮發(fā)性風(fēng)味成分和蒜氨酸酶的影響，并初步分析其作用機制，期望獲得的研究結(jié)果能為風(fēng)味濃郁的洋蔥制品和其他鹽漬蔬菜制品的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

紫皮洋蔥和食鹽：購于成都某大型超市。

烯丙基甲硫醚(色譜純)：購于阿拉丁試劑公司；丙酮酸鈉、2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)、氫氧化鈉、三氯乙酸、L-半胱氨酸、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等：均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 儀器

DS-1微量搗碎機 常州方科儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(SH-Rxi-5Sil MS色譜柱) 安捷倫公司；GL-20G-C高速冷凍離心機 上海安亭飛鴿有限公司；UV-6000PC紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 洋蔥蒜氨酸酶活性測定

1.2.1.1 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[5]

分別將0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL的0.01 mol/L丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋至50 mL，混勻后取每種濃度稀釋液4 mL放入不同試管中，然后加入5 mmol/L 2,4-DNPH溶液1 mL，混勻后于25 ℃反應(yīng)5 min，再加入2.5 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，混勻后于25 ℃下反應(yīng)10 min，于520 nm處測定反應(yīng)液的吸光度。以丙酮酸含量(x，μg)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對其進(jìn)行線性回歸后得到回歸方程為：y=37154.26x-0.02211，R2=0.9992。

1.2.1.2 蒜氨酸酶活性測定

參照秦曉春[6]的方法分別提取蒜氨酸粗酶和蒜氨酸。將1 mL粗酶液與1 mL蒜氨酸混勻后于25 ℃反應(yīng)5 min，立即加入10%(W/V)三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，然后加入5 mmol/L 2,4-DNPH溶液1 mL，混勻后于25 ℃反應(yīng)5 min，再加入2.5 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，混勻后于25 ℃下反應(yīng)10 min，于520 nm處測定反應(yīng)液的吸光度。蒜氨酸酶酶活的定義為：在25 ℃條件下，每1 min生成1 μg丙酮酸為1個酶活單位U。每種樣品平行測定3次。

1.2.2 洋蔥中硫代亞磺酸酯(TS)含量測定

參照李瑜等[7]采用紫外分光光度法測定洋蔥中TS含量。將洋蔥漿液于8000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加入3 mL適宜濃度的L-半胱氨酸溶液，25 ℃下反應(yīng)5 min，加入1.5 mmol/L DTNB溶液2 mL，用pH 7.5的磷酸緩沖溶液稀釋至25 mL，搖勻，顯色4 min，于412 nm處測定反應(yīng)液的吸光度A1。另外，用1 mL蒸餾水代替樣品液，按以上步驟測定A0。每種樣品平行測定3次。

式中：A為A0-A1；B為L-半胱氨酸的稀釋倍數(shù)；162.62為TS的相對分子質(zhì)量；14150為顯色物質(zhì)在412 nm下的摩爾吸光系數(shù)；M為所取樣品液質(zhì)量(g)，2為一分子TS消耗兩分子L-半胱氨酸。

1.2.3 食鹽濃度的影響

將新紫皮洋蔥去皮洗凈、切丁后均勻分成5份(每份100 g)，將其中4份分別與其質(zhì)量的3%、6%、9%、12%的食鹽混合，1份不加食鹽作為對照，于12 ℃下放置24 h，加入洋蔥質(zhì)量1倍的飲用純凈水后打漿1 min，測定各樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、蒜氨酸酶活力和TS含量。

1.2.4 鹽漬溫度的影響

將新紫皮洋蔥去皮洗凈、切丁后均勻分成5份(每份100 g)，與其質(zhì)量為9%的食鹽混合，其中4份于8，12，16，20 ℃鹽漬24 h，1份于4 ℃鹽漬作為對照，加入洋蔥質(zhì)量1倍的飲用純凈水后打漿1 min，測定各樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、蒜氨酸酶活力和TS含量。

1.2.5 鹽漬時間的影響

將新紫皮洋蔥去皮洗凈、切丁后均勻分成5份(每份100 g)，與其質(zhì)量為9%的食鹽混合，其中4份于20 ℃分別鹽漬12，24，36，48 h，1份加鹽洋蔥直接打漿作為對照(記為0 h鹽漬洋蔥)，加入洋蔥質(zhì)量1倍的飲用純凈水后打漿1 min，測定各樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、蒜氨酸酶活力和TS含量。

1.2.6 洋蔥揮發(fā)性成分測定

采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS法測定洋蔥揮發(fā)性成分[8]。樣品前處理：稱取5 g洋蔥漿液，加入20 μL濃度為0.4015 mg/mL 烯丙基甲硫醚(內(nèi)標(biāo))的甲醇溶液于頂空瓶中，混勻。選取50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，于50 ℃萃取30 min，迅速插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，于250 ℃解吸5 min后取出。每種樣品平行測定2次。

色譜條件：載氣為氦氣，流速為1 mL/min，不分流模式；升溫程序：柱初溫35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持3 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：采用電子轟擊離子源，溫度為230 ℃，掃描范圍35～500 m/z。

檢出化合物的質(zhì)譜圖與NIST 14/NIST 14s譜庫比對，取相似程度大于80%的化合物作為檢測結(jié)果，以烯丙基甲硫醚為內(nèi)標(biāo)物，半定量揮發(fā)性物質(zhì)的含量。以各揮發(fā)性化合物的相對含量表示鹽漬對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)的影響，相對含量指該化合物含量以各對照樣品中的含量為100%換算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果采用Origin 2017軟件繪制圖形，采用SPSS 17.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 食鹽濃度對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)的影響

食鹽濃度對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)種類及其含量的影響見表1。

表1 食鹽濃度對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)種類及其含量的影響Table 1 Effect of salt concentration on the variety and content of volatile compounds in onion

與對照(不加鹽洋蔥)相比，鹽漬后洋蔥中揮發(fā)性硫化物種類及其含量明顯增加，醛類和烷烴類物質(zhì)含量顯著降低，酸類物質(zhì)含量增加。隨著食鹽濃度增加，洋蔥含硫化合物含量先增加后降低，在食鹽濃度為9%時達(dá)到最高(85.52 mg/kg)，占揮發(fā)性化合物總量的93.33%，較未加鹽洋蔥增加了5.21倍，表明鹽漬可顯著增強洋蔥特有的風(fēng)味。此外，醛類物質(zhì)以具有青草味的2-甲基-2-戊烯醛和己醛為主，且前者是催淚物質(zhì)硫代丙醛-S-氧化物的最終降解產(chǎn)物。在鹽漬后該兩種醛類物質(zhì)的含量明顯降低，表明鹽漬洋蔥的青草味減弱，有利于洋蔥整體風(fēng)味更加柔和。

洋蔥中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要以含硫化合物和醛類物質(zhì)為主，硫化物與醛類較其他種類揮發(fā)性物質(zhì)具有更低的閾值，因此是洋蔥揮發(fā)性風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)成分[9]。Koutidou等[10]研究結(jié)果顯示二丙基二硫醚、硫代乙酸丙酯和二丙基三硫醚是洋蔥的特征香氣成分，賦予了洋蔥特有的蔥香味。本研究中，鹽漬洋蔥含有15種關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中，8種具有洋蔥特征蔥香味的物質(zhì)包括硫代乙酸丙酯(S-PrThAc)、烯丙基甲基二硫醚(MeAlDiS)、甲基丙基二硫醚(MePrDiS)、二丙基二硫醚(DiPrDiS)、甲基丙基三硫醚(MePrTrS)、二丙基三硫醚(DiPrTrS)、烯丙基硫醇(AlMec)和丙烯基丙基二硫醚(PePrDiS)；7種具有洋蔥刺激性氣味的物質(zhì)有硫代丙醛-S-氧化物(PrthS-O)、3,4-二甲基噻吩(3,4-DiMeTp)、1,3-二噻烷(1,3-Dith)、二甲基三硫醚(DiMeTrS)、二甲基四硫醚(DiMeTeS)、己醛(He)和2-甲基-2-戊烯醛(2-Me-2-Pet)[11-12]。

食鹽濃度對洋蔥15種關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的影響見圖1。

圖1 食鹽濃度對洋蔥關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的影響Fig.1 Effect of salt concentration on the relative content of key volatile flavor compounds in onion

由圖1可知，鹽漬處理后，8種具有洋蔥特征香氣的成分含量顯著增加，7種刺激性揮發(fā)性物質(zhì)中1,3-Dith、DiMeTrS和He含量明顯下降，其余物質(zhì)的含量變化不明顯，表明鹽漬處理后洋蔥的整體特征氣味更加濃郁，洋蔥香味突出，刺激性氣味有所減弱。隨著食鹽濃度增加，8種揮發(fā)性物質(zhì)相對含量先增加后降低，食鹽濃度為9%時增幅最大，相對含量增幅最大的揮發(fā)性物質(zhì)為DiPrDiS、MePrTrS和DiPrTrS。食鹽濃度為12%時，15種關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)相對含量均開始降低，S-PrThAc未檢出，但其余7種洋蔥香味揮發(fā)性物質(zhì)相對含量仍高于對照，表明食鹽濃度過高會阻礙鹽漬洋蔥的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成。綜上，當(dāng)食鹽濃度為9%時，鹽漬洋蔥的香味最濃郁。

2.2 鹽漬溫度對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)的影響

鹽漬溫度對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)種類及其含量的影響見表2。

表2 鹽漬溫度對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)種類及其含量的影響Table 2 Effect of salting temperatures on the variety and content of volatile compounds in onion

由表2可知，隨著鹽漬溫度升高，洋蔥總揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性硫化物含量增加，醛類物質(zhì)含量先增加后降低，酸類物質(zhì)含量明顯增加，但溫度并未影響鹽漬洋蔥中揮發(fā)性物質(zhì)種類變化。當(dāng)鹽漬溫度為20 ℃時，洋蔥揮發(fā)性硫化物含量達(dá)到最高(166.33 mg/kg)，占揮發(fā)性化合物總量的97.20%，比4 ℃鹽漬洋蔥增加了1.51倍，表明較高的鹽漬溫度更有利于洋蔥特征風(fēng)味的形成，且不會影響鹽漬洋蔥的整體風(fēng)味。溫度為20 ℃時，洋蔥整體揮發(fā)性風(fēng)味最強。

鹽漬溫度對洋蔥15種關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的影響見圖2。

圖2 鹽漬溫度對洋蔥關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的影響Fig.2 Effect of salting temperatures on the relative content of key volatile flavor compounds in onion

由圖2可知，鹽漬溫度對8種洋蔥特征香味物質(zhì)含量的影響不盡相同。隨著溫度升高，DiPrDiS、DiPrTrS、MePrDiS和MePrTrS的相對含量增加，于20 ℃時達(dá)到最大值；S-PrThAc、MeAlDiS、AlMec和PePrDiS的相對含量先增加后降低，這可能是因為這類揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，溫度升高會加速其降解，導(dǎo)致其含量降低。隨著溫度升高，5種刺激性揮發(fā)性成分的相對含量均降低，而Prth-S-O和2-Me-2-Pet受溫度影響顯著，其含量隨著溫度升高呈先增高后降低的趨勢，8 ℃時達(dá)到最大值。這可能是因為溫度升高不僅激活催淚因子酶的活性，同時加快Prth-S-O的降解和揮發(fā)，從而在較低溫度下催淚成分累積，20 ℃時催淚成分的生成速率小于其揮發(fā)和降解速率[13]。因此，從整體上看，20 ℃鹽漬更有利于洋蔥香味的形成與釋放，可明顯減弱其刺激性氣味。

2.3 鹽漬時間對洋蔥揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

鹽漬時間對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)種類及其含量的影響見表3。

表3 鹽漬時間對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)種類及其含量的影響Table 3 Effect of salting time on the variety and content of volatile compounds in onion

續(xù) 表

由表3可知，洋蔥總揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性硫化物含量隨鹽漬時間增加呈先增大后減小的趨勢，醛類種類顯著增加但其總量降低，酸類物質(zhì)含量先增加后降低。當(dāng)鹽漬時間為24 h時，洋蔥揮發(fā)性硫化物總量達(dá)到最大值(104.41 mg/kg)，占揮發(fā)性化合物總量的97.69%，是對照(0 h鹽漬洋蔥)的5.22倍。在鹽漬時間超過24 h后醇類和醛類物質(zhì)種類增加，這可能與耐鹽微生物繁殖有關(guān)。

鹽漬時間對洋蔥15種關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的影響見圖3。

圖3 鹽漬時間對洋蔥關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的影響Fig.3 Effect of salting time on the relative content of key volatile flavor compounds in onion

由圖3可知，隨著鹽漬時間延長，10種揮發(fā)性物質(zhì)相對含量先增加后減少，另外5種揮發(fā)性物質(zhì)相對含量明顯降低，表明鹽漬時間可明顯影響鹽漬洋蔥的揮發(fā)性風(fēng)味。在鹽漬前期(鹽漬時間≤24 h)，除MeAlDiS外，7種洋蔥香味物質(zhì)和3種刺激性物質(zhì)相對含量顯著增加，但具有洋蔥香味的揮發(fā)性物質(zhì)增幅更大，其中鹽漬24 h時，DiPrTrS的相對含量增幅最大，此時洋蔥香味較對照更加突出；此后隨著鹽漬時間延長，15種關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量均顯著降低，48 h時鹽漬洋蔥中11種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量低于對照洋蔥，洋蔥的特征風(fēng)味明顯減弱，這可能是揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)和風(fēng)味酶的活性降低有關(guān)。此外，在鹽漬36 h和48 h的洋蔥中檢測出反-2,4-癸二烯醛和順-4-庚烯醛等具有哈喇味和油脂味的成分，表明鹽漬時間過長會產(chǎn)生異味物質(zhì)。因此，鹽漬24 h時洋蔥的揮發(fā)性風(fēng)味最佳。

2.4 鹽漬對洋蔥揮發(fā)性風(fēng)味影響的作用機制

食鹽濃度、鹽漬溫度和鹽漬時間對蒜氨酸酶酶活力的影響見圖4中A，B，C?？梢钥闯?，隨著食鹽濃度的增大，洋蔥蒜氨酸酶活性呈先增強后減弱的趨勢，當(dāng)食鹽濃度為9%時，其活力最大，與未加鹽洋蔥相比，其酶活升高了161.12%。隨著鹽漬溫度提高，洋蔥蒜氨酸酶活性顯著提高，于20 ℃達(dá)最大值，與4 ℃鹽漬洋蔥相比，其酶活升高了152.20%。隨著鹽漬時間延長，洋蔥蒜氨酸酶活性先升高后降低，于24 h達(dá)最大值，與0 h鹽漬洋蔥相比，其酶活升高了125.97%。此結(jié)果與上述鹽漬對洋蔥揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化趨勢一致，表明鹽漬處理可改變洋蔥蒜氨酸酶活力，從而影響其揮發(fā)性風(fēng)味的形成。金屬離子通過影響蒜氨酸酶輔助因子5′-磷酸吡哆醛的結(jié)構(gòu)及與蒜氨酸酶主鏈的結(jié)合激活蒜氨酸酶。郭娟等[14]發(fā)現(xiàn)，Na+能顯著增強洋蔥蒜氨酸酶活性。在鹽漬初期，洋蔥細(xì)胞被破壞，蒜氨酸酶釋放，與豐富的底物和輔酶因子結(jié)合，并在Na+的激活下催化產(chǎn)生大量風(fēng)味物質(zhì)。但隨著時間延長，底物濃度和輔酶因子濃度降低，已釋放的蒜氨酸酶長時間處在高鹽濃度環(huán)境下會逐漸降解，導(dǎo)致其活力下降。因此，過高的鹽濃度和過長的鹽漬時間均不利于洋蔥蒜氨酸酶活力的保持。

圖4 鹽漬對蒜氨酸酶酶活及TS和總揮發(fā)性硫化物的影響Fig.4 Effect of salting on alliinase activity, TS and total volatile sulfides

食鹽濃度、鹽漬溫度和鹽漬時間對TS和總揮發(fā)性硫化物含量的影響見圖4中D，E，F(xiàn)?？梢钥闯?，各鹽漬條件對TS與總揮發(fā)性硫化物含量的影響與對蒜氨酸酶活的影響一致，食鹽濃度為9%、鹽漬溫度為20 ℃、鹽漬時間為24 h時分別達(dá)到最大值。并且各鹽漬條件下TS和揮發(fā)性硫化物含量有較好的線性擬合，說明TS可作為洋蔥特征揮發(fā)性風(fēng)味強度的輔助指標(biāo)，這與劉艷燦[15]關(guān)于紅蔥頭中TS含量與其感官風(fēng)味相關(guān)的研究結(jié)果一致。由圖4中D，F(xiàn)可知，不同食鹽濃度和鹽漬時間下，TS和總揮發(fā)性硫化物的擬合趨勢較好，表明食鹽濃度和鹽漬時間并未改變TS降解速率，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量僅與TS有關(guān)。由圖4中E可知，在較低溫度時，TS與總揮發(fā)性硫化物含量擬合較好，隨著溫度升高，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量增加低于TS增加。這可能是較高溫度時產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)損耗更大，從而使TS檢測值增加高于總揮發(fā)性硫化物增加。

綜上所述，鹽漬主要通過激活洋蔥中的蒜氨酸酶提高了其TS和揮發(fā)性硫化物含量，從而明顯增強洋蔥的特征風(fēng)味。

3 結(jié)論

鹽漬處理后洋蔥的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量發(fā)生顯著變化，其含量隨食鹽濃度增大和鹽漬時間的延長先增加后減少，隨鹽漬溫度升高而明顯增加。當(dāng)食鹽濃度為9%、鹽漬溫度為20 ℃、鹽漬時間為24 h時，洋蔥的總揮發(fā)性風(fēng)味成分含量和總揮發(fā)性硫化物含量最高，其特征風(fēng)味更加濃郁，同時刺激性氣味減弱。鹽漬通過提高蒜氨酸酶的活性，促進(jìn)洋蔥中TS和揮發(fā)性硫化物的生成，從而增強了洋蔥的特征風(fēng)味。