黃倩，李潔，鄭曉春，王斌，史學(xué)偉

(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000)

β-半乳糖苷水解酶(EC.3.2.1.23)又稱β-D-半乳糖苷水解酶和乳糖酶，它能催化乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，具有轉(zhuǎn)糖苷作用，是一種無毒無害的工業(yè)酶；在食品、醫(yī)藥、飼料、環(huán)保等眾多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[1]，可作為食品添加劑以防止?jié)饪s乳制品結(jié)晶等。目前，植物和動物來源的乳糖酶生產(chǎn)工藝復(fù)雜、商業(yè)成本高；而微生物來源的酶產(chǎn)量高、周期短、生產(chǎn)成本低，廣泛應(yīng)用的微生物主要是酵母菌和霉菌[2]。但霉菌來源的乳糖酶利用范圍比較窄，而酵母菌生產(chǎn)的β-半乳糖苷酶在牛奶、甜乳清和中性pH乳制品等中一直被廣泛應(yīng)用。

由于許多兒童和成人體內(nèi)缺乏能夠分解乳糖的乳糖酶，飲用牛乳后常常會引起消化不良，嚴(yán)重者會引起腹瀉、嘔吐等不適癥狀，乳糖酶的應(yīng)用能很好地解決這一問題。因此，如何篩選得到酶學(xué)性質(zhì)更為優(yōu)良的菌株尤為重要。微生物中酶的產(chǎn)量主要受發(fā)酵的物理參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基組成碳源和氮源的影響較大。利用響應(yīng)面(response surface methodology，RSM)試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以更好地優(yōu)化和確定β-半乳糖苷酶生產(chǎn)過程變量之間的相互作用[3-4]。除篩選影響發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的營養(yǎng)因子外，許多作者研究了β-半乳糖苷酶生產(chǎn)中pH、攪拌速度、底物濃度、溫度和發(fā)酵時(shí)間等因素的作用[5]。因此，本研究根據(jù)水解酶活的高低從奶酪中篩選出一株高產(chǎn)乳糖酶的菌株，采用響應(yīng)面分析的方法對該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在快速高效地增強(qiáng)菌株的產(chǎn)酶能力，為酶學(xué)特性的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

奶酪：采自新疆哈薩克族牧民家，由石河子大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；5-溴-4-氯-3-吲哚基吡喃半乳糖苷(X-Gal)：購自Takara公司；鄰硝基苯酚(ONP)和鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)：購自上海浩弘化工有限公司；國內(nèi)乳糖、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、NaCl、MnSO4、MgSO4、NaH2PO4、Na2HPO4等：由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

YPD篩選培養(yǎng)基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，X-Gal 0.002，pH為7.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂20。

YPD斜面培養(yǎng)基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，瓊脂20，pH為7.0。

YPD種子液發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，CaCl20.1，MnSO40.001，MgSO40.3，KH2PO40.05，pH 7.0。

1.3 儀器與設(shè)備

DY000500酶標(biāo)儀 蘇州藥明康德新藥開發(fā)有限公司；JY92-IIN細(xì)胞破碎儀 上海比朗儀器制造有限公司；YXQ-LS-SⅡ滅菌鍋 濟(jì)南思卓醫(yī)療器械有限公司；THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf儀器公司；TC-512 PCR擴(kuò)增儀 英國Techne公司；PowerPac Universal電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；CX21FS1光學(xué)顯微鏡 Olympus公司。

1.4 產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的分離篩選及純化

1.4.1 菌株的篩選和純化[6]

1.4.1.1 富集培養(yǎng)

將奶酪樣品配制成15%懸浮液，將5%懸浮液接種到Y(jié)PD篩選培養(yǎng)基中，加入適量的玻璃珠。在30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下孵育24 h。

1.4.1.2 篩菌

將獲得的細(xì)菌液稀釋至不同的濃度，在10-3～10-5的稀釋度中，將0.05 mL懸浮液涂布于YPD固體培養(yǎng)基，并在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。

1.4.1.3 純化

挑取單菌落在YPD平板上劃線以分離和純化菌株，并多次劃線純化以得到菌落形態(tài)大小、色澤一致的菌株進(jìn)行斜面保藏。

1.4.1.4 藍(lán)白斑篩選

純化后挑取單菌落接種到含有20 mg/mL X-Gal的固體YPD培養(yǎng)基平板中，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將產(chǎn)生藍(lán)斑的菌株進(jìn)行甘油管保藏。

1.5 高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的篩選及鑒定

1.5.1 粗酶液的制備

根據(jù)宋園亮等[7]測定乳糖酶的方法，將新鮮的種子液按3%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h后，于4 ℃、8000 r/min下離心10 min，收集上清液即為胞外粗酶液；收集濕菌體，再用50 mmol/L、pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液制成菌體懸浮液，然后利用超聲細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行破壁，超聲破碎條件：破碎效率75%，溫度4 ℃，破碎時(shí)間5 min，破碎6 s間歇3 s。破碎后的菌懸液經(jīng)4 ℃、8000 r/min冷凍離心后收集上清液，即為胞內(nèi)β-半乳糖苷酶粗酶液，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.5.2 酶活測定

將粗酶液置于37 ℃的水浴鍋中溫育10 min后取50 μL于酶標(biāo)板中，每個樣取3次求平均值。加入經(jīng)37 ℃預(yù)熱的20 mmol/L的ONPG 50 μL，并于37 ℃下反應(yīng)10 min，最后吸取200 μL 0.5 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，于420 nm下測吸光度值。挑選出酶活最高的一株做后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

酶活定義：每毫升粗酶液在每分鐘內(nèi)催化底物ONPG生成1 μmol ONP所需的酶量為1個酶活單位(U)，酶活計(jì)算公式：

式中：M為在試驗(yàn)條件下1 μmol/mL ONP的吸光度值；V1為反應(yīng)混合液總體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；V2為酶液體積(mL)。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取139.0 mg的ONP放入燒杯中，加入10 mL 95%乙醇溶解，最后采用pH為7.0的PBS緩沖液于1000 mL的容量瓶中定容并顛倒混勻。

分別吸取定容好的溶液 2，4，6，8，10，12，14 mL于100 mL容量瓶中，用1%碳酸氫鈉定容混勻，以PBS緩沖液為空白，于420 nm波長處測吸光度，得到ONP濃度曲線[8]。

1.5.4 26S rDNA PCR鑒定

菌體DNA的提取采用天根真菌DNA 提取試劑盒，根據(jù)試劑盒提供藥品以及說明書步驟進(jìn)行DNA的提取。

引物：ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)；

ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。

反應(yīng)體系(25 μL)：DNA模板2 μL，上、下游引物(25 μmol/L)各0.5 μL，2×Taq DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，3 min，共循環(huán)30次；最后延伸72 ℃，10 min。結(jié)束后，將產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，觀察結(jié)果后測序[9]。

將符合標(biāo)準(zhǔn)的26S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果用NCBI(National Center for Biotechnology Information)Blast進(jìn)行同源序列比對，根據(jù)結(jié)果，用Claustal X1.83軟件對下載的相似性為99%以上菌種的26S rDNA序列和測序菌株的序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果采用Mega 6.0軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并對進(jìn)化樹采用Bootstrap進(jìn)行1000次置信度分析[10]。

1.6 單因素試驗(yàn)

1.6.1 溫度

將4 ℃保存的粗酶液分別置于27，37，45，55，65，75，85 ℃下溫育10 min后于420 nm下測吸光度值[11]。每個試驗(yàn)組設(shè)3次重復(fù)，以平均值做統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.2 pH

將粗酶液用pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的PBS緩沖溶液制成懸浮液，破壁離心后測定其酶活。

1.6.3 破壁時(shí)間

將PBS制成的懸浮液分別進(jìn)行破壁，破壁時(shí)間為2，5，8，11，14，17，20 min，之后測定其在420 nm波長下的吸光度值。

1.6.4 乳糖濃度

分別在培養(yǎng)基中加入0，5，10，15，20，25，30 g/L的乳糖進(jìn)行搖床培養(yǎng)，破壁后測定其酶活，每組數(shù)據(jù)取3次平行。

1.6.5 金屬離子

分別在培養(yǎng)基中加入0.01 mol/L的Na+、K+、NH4+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+于30 ℃，200 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h后測定其酶活，然后將促生長因子的濃度調(diào)為0.001，0.002，0.003 g/L。

1.6.6 接種量

以1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的接種量將種子液接入液體搖瓶培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)后測定其吸光度值。

1.7 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.7.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選顯著因素

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)方法，對影響產(chǎn)酶的6個因素進(jìn)行考察，即乳糖濃度、細(xì)胞破碎時(shí)間、初始pH值、破壁時(shí)間、溫度和金屬離子。每個因素采用高、低2個水平，分別記為1，-1，以乳糖酶相對活性為響應(yīng)值，設(shè)定3個平行試驗(yàn)，各因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.7.2 最陡爬坡試驗(yàn)

在對Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，以效應(yīng)值的正負(fù)為爬坡方向，以效應(yīng)值的大小確定變化步長，逼近最大響應(yīng)區(qū)域[12]。其他因素的取值由各因素效應(yīng)值的正負(fù)和大小決定，正效應(yīng)的因素取高水平值，負(fù)效應(yīng)的因素取低水平值。

1.7.3 響應(yīng)面(RSM)分析

通過Plackett-Burman試驗(yàn)及最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面分析的這幾個因素及其中心點(diǎn)[13]，然后采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，優(yōu)化該菌株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的條件，并在最佳的產(chǎn)酶條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，證實(shí)響應(yīng)面的可靠性。

1.7.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design Expert 8進(jìn)行響應(yīng)面分析，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman test design

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)白斑篩選

將奶酪樣品稀釋通過涂布挑菌純化后，在篩選純化所得到的菌株中，通過添加X-Gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選得到9株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株，見圖1 。

圖1 藍(lán)白斑初篩結(jié)果Fig.1 The blue-white preliminary screening results

由圖1可知，具有產(chǎn)乳糖酶的菌株會呈現(xiàn)藍(lán)色，產(chǎn)酶的能力不同，呈現(xiàn)的顏色深淺不一樣，其中y-2的藍(lán)斑顏色最深，說明其產(chǎn)乳糖酶的能力可能很高，而菌株y-4、y-7、y-8產(chǎn)乳糖酶的能力較低。

2.2 水解酶活測定及菌種鑒定

通過測定9株菌株中產(chǎn)乳糖的能力，得到胞內(nèi)和胞外的水解酶活，見圖2。

圖2 胞內(nèi)和胞外酶活Fig.2 The intracellular and extracellular enzyme activities

由圖2可知，y-8和y-9的胞內(nèi)酶活和胞外酶活相差不大，其他幾株菌的胞內(nèi)酶活都在250 U/mL 以上，且都顯著比胞外酶活高，說明β-半乳糖苷酶主要以胞內(nèi)酶的形式存在于菌株內(nèi)。胞內(nèi)酶活中y-2的酶活最高，達(dá)到了382 U/mL其次是y-1，為362 U/mL，y-8和y-9的酶活最低，分別為78，82 U/mL；胞外酶活中y-6的酶活最高，為106 U/mL，y-8的酶活最低，為72 U/mL。

26S rDNA序列擴(kuò)增的片段長度為750 bp，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3中A。在GenBank上進(jìn)行Blast比對，從GenBank中得到序列相近的參比菌株，采用臨近法以Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3中B。

圖3 PCR擴(kuò)增結(jié)果(A)及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(B)Fig.3 The PCR amplification results (A) and construction of its phylogenetic tree(B)

由圖3中B可知，y-1、y-4、y-5、y-6、y-7與乳酸克魯維酵母的親源性較高，y-2、y-3屬于馬克斯克魯維酵母，y-8、y-9是庫德里阿茲威氏畢赤酵母。

2.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)水解酶活的高低挑選出菌株y-2做單因素試驗(yàn)，由圖4可知，通過將粗酶液在不同溫度下溫育后測定相對酶活發(fā)現(xiàn)，37 ℃的相對酶活最高，表明β-半乳糖苷酶的最適溫度為37 ℃，隨著溫度的升高，酶活逐漸下降，這是由于高溫破壞了酶的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶發(fā)生了變性，所以活性降低[14]。β-半乳糖苷酶的最適pH為7，表明β-半乳糖苷酶是一種中性酶。

圖4 不同溫度和pH下的相對酶活Fig.4 The relative enzyme activities at different temperatures and pH values

由圖5可知，破壁時(shí)間為5 min時(shí)的酶活最高，但隨著破壁時(shí)間的延長，酶活越低，這可能是酶在破壁過程中喪失；與空白對照相比，金屬離子Na+、K+、NH4+是促生長因子，而其他的金屬離子與空白相比反而抑制了菌的生長。

圖5 不同破壁時(shí)間和金屬離子下的相對酶活Fig.5 The relative enzyme activities at different wall breaking time and metal ions

由圖6可知，乳糖濃度為10 g/L時(shí)的相對酶活最高；接種量較大導(dǎo)致大量菌體繁殖，迅速消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，不利于菌株產(chǎn)酶[15]。由此，可以初步確定菌株產(chǎn)酶的最適接種量為4%。

圖6 不同乳糖濃度和接種量下的相對酶活Fig.6 The relative enzyme activities at different lactose concentration and inoculation amount

由圖7可知，Na+的濃度為0.001 g/L時(shí)的相對酶活最高，這是因?yàn)榻饘匐x子的濃度增高反而會對菌的生長產(chǎn)生副作用，從而抑制乳糖酶的相對含量。

圖7 Na+的濃度對酶活的影響(A)及ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.7 The effect of Na+ concentration on enzyme activity (A) and the standard curve of ONP(B)

2.4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選結(jié)果

在6個單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用 Plackett-Burman設(shè)計(jì)創(chuàng)建試驗(yàn)次數(shù)N=12的試驗(yàn)，對6個因素進(jìn)行考察。每個因素取高水平和低水平2個水平，以乳糖酶相對活力為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Plackett-Burman (PB) test design and response value results

續(xù) 表

由表3可知，Prob>T值(P值) 的大小表明各個考察因素的顯著水平，當(dāng)Prob>T值<0.05 時(shí)表明各因素有顯著影響。6個因素中pH、溫度、乳糖濃度對產(chǎn)酶的影響極顯著，顯著性比較：pH>溫度>乳糖濃度。后續(xù)的試驗(yàn)中其他3個因素均選取最優(yōu)值進(jìn)行。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素水平及顯著性分析Table 3 The analysis of the factors and significance of each factor in Plackett-Burman test design

2.5 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以SPSS軟件對P-B設(shè)計(jì)方法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各因素中影響顯著性的因素是pH、溫度、乳糖濃度。因此，pH、溫度、乳糖濃度對乳糖酶酶活存在著較顯著的影響，確定其為下一步試驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素。根據(jù)篩選出3個主要影響因素的效應(yīng)和大小比例，設(shè)定最陡爬坡試驗(yàn)的變化方向和步長，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 4 The steepest climbing test design and the results

2.6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.6.1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及回歸模型的建立在Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定了幾個主要影響因素及響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)對pH、溫度、乳糖濃度進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5和表6，該響應(yīng)面試驗(yàn)共有15個試驗(yàn)點(diǎn)，其中1～12為分析點(diǎn)，13～15為零點(diǎn)，每個重復(fù)3次以評估試驗(yàn)的誤差。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 5 The factors and levels of Box-Behnken test design

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 The Box-Behnken test design and results

2.6.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及回歸模型

運(yùn)用Design Expert 8軟件對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以乳糖酶相對酶活(Y)為因變量，pH (X1)、溫度(X2)和乳糖濃度(X3)為自變量建立回歸方程：

Y = 96.17-0.11X1-0.4X2-0.74X3+4.32X1X2+0.79X1X3-1.60X2X3-7.97X12-4.78 X22-2.10 X32。

對該方程進(jìn)行回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和方差分析，見表7和表8。

表7 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 7 The significance test of the quadratic model's regression coefficients

續(xù) 表

表8 回歸方程的方差分析Table 8 The variance analysis of regression equation

由表7可知，一次項(xiàng)中3個因素對酶活力的影響排序?yàn)椋簻囟?pH>乳糖濃度，且Prob>T表明對Y值的影響顯著；二次項(xiàng)中X1，X2顯著，X3不顯著；交互項(xiàng)中X1X2對酶活力顯著，X1X3、X2X3對酶活力不顯著。說明單因素、各單因素平方對酶活影響較大，各因素間的交互作用影響較小?；貧w系數(shù)R2=93.25%>91.62%，表明該模型摸擬不同因素對菌株y-2產(chǎn)β-半乳糖苷酶酶活的影響效果較好，試驗(yàn)過程設(shè)計(jì)合理，該模型成立。

由表8可知，失擬項(xiàng)數(shù)值為0.361，遠(yuǎn)大于0.05，說明失擬不顯著，該模型穩(wěn)定，可以作為不同因素水平對酶活影響的預(yù)測。

2.6.3 響應(yīng)面分析

利用軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到響應(yīng)面及等高線圖，見圖8～圖10。

圖8 溫度與pH對β-半乳糖苷酶相對酶活的等高線圖和響應(yīng)面立體分析圖Fig.8 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of temperature and pH on the relative activity of β-galactosidase

圖9 溫度與乳糖濃度對β-半乳糖苷酶相對酶活的等高線圖和響應(yīng)面立體分析圖Fig.9 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of temperature and lactose concentration on the relative activity of β-galactosidase

圖10 pH與乳糖濃度對β-半乳糖苷酶相對酶活的等高線圖和響應(yīng)面立體分析圖Fig.10 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of pH and lactose concentration on the relative activity of β-galactosidase

由圖8～圖10可直觀地看出各因子對響應(yīng)值的影響變化趨勢，并且模型確實(shí)存在最大值。從等值線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。等高線的形狀可以反映交互效應(yīng)的大小，橢圓形表示兩個因素的交互作用顯著，圓形表示兩個因素的交互作用不顯著。pH和溫度、pH和乳糖濃度對酶活的交互作用顯著；溫度和乳糖濃度對酶活的交互作用顯著性不明顯。

3 結(jié)論

通過對新疆哈薩克族奶酪中的菌株進(jìn)行篩選和純化，然后添加顯色劑最終篩選得到9株產(chǎn)乳糖酶的菌株，經(jīng)過水解酶活測定和菌種鑒定，得到一株高產(chǎn)乳糖酶的菌株y-2，鑒定為馬克斯克魯維酵母，根據(jù)溫度、pH、破壁時(shí)間、乳糖濃度、金屬離子和接種量這6個單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著性的因素是pH、溫度、乳糖濃度，最后通過響應(yīng)面分析得出pH和溫度、pH和乳糖濃度對酶活的交互作用顯著；溫度和乳糖濃度對酶活的交互作用顯著性不明顯。