魏玉嬌，郭曉強(qiáng)，周婷

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106)

美拉德反應(yīng)又稱褐變反應(yīng)，是羰基化合物和氨基化合物的組合反應(yīng)，改變食品的色澤和風(fēng)味[1], 在食品加工處理過程中很常見[2]。殼聚糖是甲殼素脫乙酰后(D.D)的產(chǎn)物[3]，是一種天然的堿性多糖。因其結(jié)構(gòu)中含有大量的COOH和NH2，所以它只能溶于稀的有機(jī)酸溶液中，這使它的應(yīng)用受到一定限制[4]。羧甲基殼聚糖(CAS)是殼聚糖改性后的產(chǎn)物。它有很多活性，如增稠、分散、乳化、保濕等。相比于殼聚糖，改性后的CAS在酸性和堿性溶液中均能溶解[5]。酪蛋白(CN)含有人體需要的多種氨基酸，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的完整蛋白質(zhì)，常被當(dāng)作食品添加劑，有乳化、增稠等作用。其等電點(diǎn)為4.6，一般溶于堿性溶液，不溶于酸性溶液，限制了它的應(yīng)用。改變蛋白質(zhì)性質(zhì)的方法有很多，MRPs是改變蛋白功能特性的有效方法[6]。這種方法安全、綠色，且能進(jìn)一步提高原料的功能特性，減少原料用量，降低原料成本，拓展它們的應(yīng)用領(lǐng)域[7]。

在食品領(lǐng)域中，CN和CAS在美拉德反應(yīng)反面也有研究，谷風(fēng)林[8]做了酪蛋白和葡萄糖的結(jié)合物，證明了在煙草膨莖中添加MRPs可以顯著提高煙草香氣的使用價(jià)值和擴(kuò)大莖絲。趙靜等[9]確定了美拉德反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件，并在最佳條件下發(fā)現(xiàn)了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性和自由基清除率。文獻(xiàn)[10]通過美拉德反應(yīng)，為研發(fā)天然的、綠色的抗氧化劑提供了新的方法，制得了一種溶解性和抗氧化能力都更好的產(chǎn)物。文獻(xiàn)[11]使用MRPs對(duì)天然的防腐劑進(jìn)行了改良，制備了一種多功能的食品添加劑，拓展了天然防腐劑的使用。

殼聚糖因水溶性較差，將其改性后得到CAS可以擴(kuò)增它的應(yīng)用[12]。酪蛋白的營養(yǎng)價(jià)值很高，美拉德反應(yīng)可以提高酪蛋白的特性。它綠色、安全，被認(rèn)為是一種前景很好的方法，可以明顯改善蛋白質(zhì)的功能和性質(zhì)。提高蛋白質(zhì)的抗氧化性，生成有抑制各種菌活性的、抗過敏和抗癌作用的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[13]。本文用干熱法制備美拉德產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行表征，對(duì)蛋白質(zhì)的改性研究以及擴(kuò)展羧甲基殼聚糖的應(yīng)用都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

殼聚糖(脫乙酰度95.2%)、酪蛋白氨基酸：食品級(jí)，源葉生物化學(xué)試劑有限公司；異丙醇、磷酸二氫鉀、溴化鉀、四硼酸鈉：分析純，麥客林化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇：化學(xué)純，麥客林化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

IS10傅立葉紅外光譜儀 ThermoFisher公司；FW-5壓片機(jī) 傅天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司；ZNCL-B磁力攪拌器 科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCIENTZ-10M冷凍干燥機(jī) 新芝生物科技股份有限公司；AR224CN分析天平 奧豪斯儀器有限公司；BG-06D超聲波清洗機(jī) 邦杰電子產(chǎn)品有限公司；UB-10 pH計(jì) 丹佛儀器有限公司；DD5N低速大容量離心機(jī) 凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 羧甲基殼聚糖的制備

準(zhǔn)確稱取4 g CAS，加入40 mL 40%濃度的預(yù)配制NaOH溶液，堿性環(huán)境中超聲30 min，使其充分溶解。再加入100 mL異丙醇，于30 ℃在磁力攪拌器上攪拌1 h。稱取16 g氯乙酸并溶于40 mL異丙醇溶液中。反應(yīng)完成后，加入200 mL的95%乙醇溶液停止反應(yīng)。滴加乙酸將反應(yīng)體系的pH調(diào)至中性，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液和無水乙醇清洗羧甲基殼聚糖濾餅，抽濾，收集沉淀。50 ℃干燥直至恒重，干燥后將其研磨成粉末狀，即得到羧甲基殼聚糖樣品。

1.3.2 酪蛋白-羧甲基殼聚糖反應(yīng)產(chǎn)物的制備

反應(yīng)產(chǎn)物的制備參考雷濤等[14]的方法并稍作改動(dòng)。將酪蛋白和羧甲基殼聚糖加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，在室溫下磁力攪拌1 h使其完全溶解并制備成均勻濃度的溶液。按一定比例(蛋白和多糖比為5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、1∶1、4∶5、3∶5)制成含酪蛋白10%的混合溶液，于室溫下超聲攪拌1 h，使糖和蛋白充分混合均勻。預(yù)凍24 h后再冷凍干燥48 h，研磨成粉末。過篩，放入含有飽和溴化鉀的密封容器中(相對(duì)濕度為79%)并將反應(yīng)溫度控制在50，55，60，65，70 ℃， pH為7.4，反應(yīng)時(shí)間控制在24，36，48，60，72，84 h中讓其反應(yīng)， 達(dá)到反應(yīng)時(shí)間后冷卻終止反應(yīng)。取適當(dāng)?shù)娜ルx子水溶解樣品，離心15 min，取上清液，凍干，研磨即得到樣品。

1.4 美拉德產(chǎn)物的性能測(cè)定

1.4.1 褐變指數(shù)的測(cè)定

分別稱取不同條件下的反應(yīng)產(chǎn)物0.5 g于試管中，加入15 mL去離子水將其充分溶解。使用分光光度計(jì)，在420 nm波長下測(cè)量其吸光度。

1.4.2 接枝度的測(cè)定

為了測(cè)定游離氨基含量并計(jì)算接枝程度，使用OPA法。

OPA(鄰苯二甲醛)試劑的配制：使用分析天平準(zhǔn)確稱取40.0 mg OPA到100 mL燒杯中。吸取管中的1.0 mL甲醇。20%(W/W)的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液的配制：稱取2 g十二烷基硫酸鈉，溶解于10 mL去離子水中。0.1 mol/L的硼砂溶液的配制：準(zhǔn)確稱取3.814 g硼砂，加入100 mL去離子水，超聲直至其完全溶解。分別取5 mL SDS溶液和25 mL硼砂溶液(0.1 mol/L)加入到裝有OPA試劑的燒杯中，再加入100 μL的β-巰基乙醇，然后將燒杯中的液體轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，并用超純水調(diào)節(jié)體積。

取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL不同比例、不同時(shí)間、不同溫度反應(yīng)前后的樣品溶液，搖勻，35 °C，水浴2 min。倒入石英比色皿中，置于分光光度計(jì)中測(cè)量。以200 μL去離子水作為空白對(duì)照，按下式計(jì)算接枝度：

GD(%)=(A0-A1)/A0×100。

式中：A0為反應(yīng)前溶液的吸光度值；A1為反應(yīng)后溶液的吸光度值。

1.4.3 自由氨基含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量0.1 g的樣品，向其中加入10 mL的去離子水，使用磁力攪拌機(jī)，使樣品溶解形成分布均勻的溶液。取事先配制好的OPA溶液4 mL和已經(jīng)溶解均勻的樣品溶液200 μL加入試管中，搖晃混勻，35 ℃水浴2 min。使用分光光度計(jì)在340 nm處測(cè)量其吸光值，所得到的結(jié)果稱為A樣。在同樣的環(huán)境和條件下，以未經(jīng)過處理的酪蛋白為A標(biāo)，去離子水為空白對(duì)照。按照下式對(duì)所配制的樣品中游離氨基含量進(jìn)行測(cè)定：

式中：A樣為OPA試劑加入樣品在 340 nm處的吸光度值；A空為OPA試劑加入水在340 nm處的吸光度值；A標(biāo)為OPA試劑中加入酪蛋白在340 nm處的吸光度值。

1.4.4 傅立葉紅外光譜

取事先烘干的不含有任何水分的樣品約1 mg放入干凈的瑪瑙研缽中， 在紅外燈下研磨成細(xì)粉。估量加入150 mg干燥的且已經(jīng)在紅外燈下事先研磨好的 KBr一起研磨到它們完全、均勻的、充分地混合，讓它們的粒度為2 μm以下(樣品與 KBr的比例為1∶100～1∶200)，將適量的混合樣品放入干凈的模具中，輕輕搖動(dòng)模具使樣品均勻，然后用手壓機(jī)將其壓成透明片材。在電腦上設(shè)置范圍，之后將薄片放到光路中測(cè)定紅外光譜，一般先采集KBr背景的紅外光譜測(cè)定，然后再采集樣品，范圍為4000～400 cm。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)所測(cè)樣品數(shù)據(jù)均檢測(cè)3次，用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Duncan多重比較進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白和多糖比例對(duì)反應(yīng)的影響

控制反應(yīng)條件pH一定，濕度一定，溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為72 h。CAS/CN對(duì)反應(yīng)的影響見表1。

表1 蛋白和糖比例對(duì)反應(yīng)的影響Table 1 The effects of protein and sugar ratio on the reaction

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，不同濃度的酪蛋白和糖對(duì)美拉德反應(yīng)的接枝率和游離氨基含量有顯著影響(P<0.05)。對(duì)褐變指數(shù)也有顯著影響(P<0.05)。反應(yīng)底物的用量變化可以影響反應(yīng)速度。適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)比例避免了副反應(yīng)的發(fā)生并且可以提高反應(yīng)速率。當(dāng)?shù)鞍缀吞菨舛炔粩嘣龃髸r(shí)，它們之間碰撞的機(jī)會(huì)會(huì)增大很多，這樣有利于反應(yīng)的進(jìn)行。然而，蛋白質(zhì)分子和多糖分子受到空間阻礙，當(dāng)濃度增加到一定程度時(shí)，它們之間的碰撞概率會(huì)降低，這對(duì)反應(yīng)是非常不利的。由表1可知，隨著酪蛋白和多糖比例的增加，接枝度先增大后減小，當(dāng)?shù)孜锉葹?∶4時(shí)，褐變指數(shù)在0.4左右，褐變程度最大，接枝程度最大，游離氨基含量最低。說明蛋白中的氨基減少，發(fā)生了反應(yīng)。pH值也先不斷下降后趨于平穩(wěn)，因此蛋白和糖的比例在5∶4左右最適宜。

2.2 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

控制反應(yīng)條件，蛋白和糖的比例為5∶4，pH值一定，濕度不變，不同溫度對(duì)反應(yīng)的影響見表2。

表2 溫度對(duì)反應(yīng)的影響Table 2 The effect of temperature on the reaction

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)中溫度起著很重要的作用。當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，溫度對(duì)褐變指數(shù)(P<0.05)有顯著影響。褐變指數(shù)隨著溫度的升高而增加，但在60 ℃后，褐變指數(shù)緩慢下降。 當(dāng)溫度小于時(shí)60 ℃，溫度對(duì)接枝度與自由氨基含量有顯著的影響(P<0.05)，接枝度隨著溫度的增大而增大，自由氨基含量隨著溫度的增大而減小。 當(dāng)溫度大于60 ℃時(shí)，接枝度的增長趨于平緩，再升高溫度對(duì)接枝度和自由氨基含量影響不顯著(P>0.05)。pH值逐漸減小，是因?yàn)榘被嵩趬A性介質(zhì)中表現(xiàn)為陰離子，反應(yīng)性較強(qiáng)，容易發(fā)生反應(yīng)。發(fā)生反應(yīng)之后，氨基也被消耗，所以自由氨基含量下降，接枝度增加，pH值不斷下降。因此，選擇60 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.3 時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

控制反應(yīng)條件，溫度60 ℃，pH恒定，濕度恒定，蛋白質(zhì)和糖的比例為5∶4，不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響見表3。

表3 時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響Table 3 The effect of time on the reaction

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于72 h時(shí)，pH值緩慢下降，時(shí)間對(duì)接枝度和游離氨基含量有顯著影響(P<0.05)。時(shí)間達(dá)到72 h后，接枝度增長趨勢(shì)漸緩，再升高溫度對(duì)接枝度影響不顯著(P>0.05)，隨著時(shí)間的延長，褐變指數(shù)逐漸增加，效果顯著(P<0.05)。

在蛋白質(zhì)和多糖之間的反應(yīng)中，可能發(fā)生還原性醛基和氨基之間的反應(yīng)。因此，反應(yīng)開始后，隨著不斷地加熱，蛋白中的氨基隨著結(jié)構(gòu)的展開慢慢暴露在分子的表面，加熱后糖和蛋白質(zhì)連續(xù)結(jié)合，并且接枝程度逐漸增加。但是過度加熱后會(huì)使蛋白質(zhì)分子中的氨基酸結(jié)構(gòu)被破壞，而且會(huì)增加蛋白質(zhì)之間的相互作用，導(dǎo)致凝聚和沉淀，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生不利影響。因此，在72 h時(shí)接枝度最大，游離氨基含量最小，褐變指數(shù)為0.6左右，褐變程度較大。

2.4 美拉德產(chǎn)物的紅外光譜分析

本實(shí)驗(yàn)的目的是為了進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)和多糖是否發(fā)生反應(yīng)以及反應(yīng)過程的變化。而紅外光譜可以通過不同的吸收峰來表明反應(yīng)。圖中A代表混合物，B代表美拉德產(chǎn)物，C代表酪蛋白。

當(dāng)?shù)鞍缀吞欠肿咏Y(jié)合后，最明顯的變化就是蛋白質(zhì)分子中的羥基增多。具體表現(xiàn)在紅外光譜圖上是，在1700～1000 cm-1時(shí)出現(xiàn)吸收峰，在3700～3200 cm-1時(shí)出現(xiàn)一個(gè)寬峰。由圖1可知，B在3700～3200 cm-1和1700～1000 cm-1的吸收對(duì)比酪蛋白都有所增加，它們分別是-OH和-CO鍵的吸收峰。由圖1可知，在1650 cm-1處，B的吸收減弱，說明蛋白中的氨基參與了反應(yīng)，數(shù)量明顯減少。

圖1 紅外光譜圖Fig.1 The infrared spectrogram

3 結(jié)果與討論

國內(nèi)外研究蛋白質(zhì)的改性主要有物理改性、化學(xué)改性和酶改性等方面。其中化學(xué)改性中的美拉德改性受到越來越多的關(guān)注，美拉德改性與其他化學(xué)改性相比簡(jiǎn)單、安全，而且還能改善蛋白質(zhì)的多種功能性質(zhì)。本文運(yùn)用干熱法使酪蛋白與羧甲基殼聚糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，進(jìn)一步深入研究美拉德反應(yīng)的條件，從而延伸和拓寬酪蛋白和羧甲基殼聚糖的應(yīng)用領(lǐng)域。

本研究制備了酪蛋白和羧甲基殼聚糖的美拉德產(chǎn)物，并對(duì)產(chǎn)物的一系列特性進(jìn)行了表征，測(cè)定了不同蛋白和多糖的比例、不同溫度、不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響。通過測(cè)定產(chǎn)物的pH值、褐變指數(shù)、自由氨基含量、接技度來確定最佳反應(yīng)條件。最終結(jié)果表明最適宜反應(yīng)條件是在60 ℃，相對(duì)濕度為79%，CN/CAS比例為5∶4，最終蛋白質(zhì)濃度為10%的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)72 h具有最高的反應(yīng)程度。 測(cè)得其褐變指數(shù)為0.697，接枝度為70.09%，自由氨基含量為28.83%。CN、CN/CAS和MRPs的紅外光譜表明，酪蛋白與羧甲基殼聚糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。