任 榮，楊博睿，彭海帥，王畢妮*，張富新，惠媛媛，賈 蓉

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

乳類物質(zhì)是一種營養(yǎng)豐富的理想食品，富含人體生長發(fā)育的必需氨基酸、短中鏈脂肪酸以及鉀、磷、鈣和其他礦物質(zhì)[1]。人類食用乳及乳制品的歷史悠久，早在古代李時(shí)珍所著的《本草綱目》就指出：奶汁主治補(bǔ)五臟，令人肥白悅澤、益氣、治瘦悴、悅皮膚、潤毛發(fā)[2]。乳中營養(yǎng)成分的含量和種類受遺傳、生理及環(huán)境條件等影響，其中產(chǎn)乳動(dòng)物的品種多樣化一定程度影響乳中蛋白質(zhì)合成水平、肽鏈的磷酸化和糖基化及氨基酸序列[3]。目前，市場(chǎng)上的乳及乳制品主要以牛乳和羊乳為原料，其他小眾乳在特定區(qū)域同樣具有重要的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，例如駝乳、馬乳、驢乳、鹿乳等，其口味和營養(yǎng)成分也因種類、飼料、環(huán)境和擠乳環(huán)境等有很大差異[4]。

奶牛養(yǎng)殖規(guī)模大、產(chǎn)量高、品種豐富，牛乳已成為越來越多消費(fèi)者生活中必不可缺的飲食選擇。近年來，隨著羊乳的營養(yǎng)價(jià)值逐漸被更多的消費(fèi)者所認(rèn)知，羊乳市場(chǎng)不斷擴(kuò)大，世界羊乳消費(fèi)量總體上持續(xù)增長[5]。牛乳中蛋白質(zhì)種類較多，酪蛋白和葉酸含量均較高；而羊乳中脂肪球較小，含有更多的不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)因子[6]。牛乳和羊乳作為乳品行業(yè)開發(fā)和研究的主要乳源，研究者們?cè)谘邪l(fā)嬰幼兒乳粉時(shí)也一直致力于調(diào)整其營養(yǎng)成分，使其更接近于人乳，從而確保嬰兒的腸道消化和營養(yǎng)吸收。蛋白質(zhì)作為乳中的關(guān)鍵成分，具有多種分子功能。例如，酪蛋白膠束提供對(duì)能量、組織生長和細(xì)胞功能至關(guān)重要的必需氨基酸。此外，一些蛋白質(zhì)可以作為激素或抗菌物質(zhì)等[7]。因此研究不同品種乳中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，可以在分子層面上深入了解相應(yīng)的營養(yǎng)特性，獲得特定的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，為消費(fèi)者健康飲食提供指導(dǎo)。

蛋白質(zhì)組學(xué)是解析蛋白質(zhì)成分的主要技術(shù)手段。自20世紀(jì)90年代將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于牛乳研究，鑒定了6 種主要蛋白質(zhì)及其遺傳變異體外，取得了重大進(jìn)展。目前國內(nèi)外的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)十分成熟，能夠檢測(cè)、識(shí)別和量化蛋白質(zhì)，如生物活性肽[8]、乳清蛋白[9]及乳脂肪球膜蛋白[10]。關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)應(yīng)用以及在哺乳期、乳品加工和貯藏期間蛋白質(zhì)的變化，已經(jīng)有許多相關(guān)研究報(bào)道[11-13]。本研究通過研究羊乳、牛乳和人乳的基本成分，并通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)對(duì)3 種乳中所含有的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，通過基因本體論（gene ontology，GO）注釋、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析不同品種乳中的蛋白質(zhì)富集程度及所發(fā)揮的分子功能，探究可能影響其品質(zhì)的潛在關(guān)鍵蛋白，為后續(xù)蛋白質(zhì)調(diào)控研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳取自飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)的30 只Saanen山羊；牛乳采自西安銀橋乳業(yè)公司飼養(yǎng)的30 只黑白花乳牛；人乳由西安市3 名處于哺乳期的女性志愿者提供。采樣時(shí)充分混合，-80 ℃貯藏。

尿素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘代乙酰胺 美國Sigma公司；甲酸、乙腈、四乙基溴化銨（tetraethyl-ammonium bromide，TEAB） 美國Fisher Chemical試劑公司；蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶 美國Promega試劑公司；BCA試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZORBAX 300 Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美 國A g i l e n t公 司；F D U-1 2 0 0真 空 冷 凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司；UPLC系統(tǒng)（EASYnLC 1000）、Q ExactiveTMPlus組合型四極桿-OrbitrapTM質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 乳成分分析

樣品室溫解凍后，利用乳成分分析儀測(cè)定羊乳、牛乳和人乳中的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)、干物質(zhì)含量，重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.2 蛋白溶液制備

上述解凍后的乳樣3 500 r/min離心10 min，去除上層脂肪，余下清液和蛋白質(zhì)沉淀混合均勻。準(zhǔn)確吸取100 μL，加入400 μL裂解緩沖液（含8 mol/L尿素、1 g/100 mL蛋白酶抑制劑），在細(xì)胞破碎儀中400 W超聲裂解20 s，12 000×g低溫離心10 min，收集上清液轉(zhuǎn)移至新的潔凈離心管，按照BCA試劑盒說明書步驟測(cè)定各樣品總蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 蛋白質(zhì)酶解消化

取50 μL 1.3.2節(jié)所得上清液，加入等體積25 mmol/L NH4HCO3溶液（含10 mmol/L DTT），56 ℃水浴30 min進(jìn)行蛋白質(zhì)還原反應(yīng)；反應(yīng)完成后將混合液取出冷卻至室溫，迅速加入等體積0.1 mol/L烷基化試劑（25 mmol/L NH4HCO3溶液，含55 mmol/L碘代乙酰胺），室溫下暗反應(yīng)30 min；最后通過添加0.1 mol/L TEAB緩沖溶液將每個(gè)樣品溶液尿素濃度稀釋至2 mol/L，以胰蛋白酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1∶100添加胰蛋白酶，37 ℃酶解消化3 h，再以質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，2 次消化過夜。消化完成后向混合體系中添加50 μL體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液終止酶解反應(yīng)，4 ℃、12 000×g離心10 min，得到酶切肽段上清液[14]。

1.3.4 肽段純化

肽段上清液用反相UPLC分級(jí)，色譜柱為Agilent 300 Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。肽段分級(jí)流動(dòng)相梯度設(shè)置為8%～32%乙腈、pH 9.0，1 h內(nèi)分離出60 個(gè)組分，合并為4 組，再經(jīng)真空冷凍干燥后保存在-80 ℃冰箱內(nèi)，待測(cè)[15]。

1.3.5 UPLC-MS/MS分析

肽段使用EASY-nLC 1000 UPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離，電離后在Q ExactiveTMPlus質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析。分析條件參考周玉成等[16]的方法，其中掃描條件作出一定調(diào)整：一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z350～1 800，掃描分辨率70 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z200，掃描分辨率17 500。

1.3.6 NCBI數(shù)據(jù)庫搜索

使用Maxquant搜索引擎（http://www.maxquant.org/）檢索NCBICapra hircus數(shù)據(jù)庫，胰蛋白酶被指定為裂解酶，缺失裂解數(shù)目設(shè)置為2。一級(jí)母離子的質(zhì)量容限設(shè)置為20 Da，二級(jí)碎片離子的質(zhì)量容限設(shè)置為0.02 Da。半胱氨酸上的烷基化設(shè)為固定修飾，甲硫氨酸的氧化、蛋白N端的乙?；?、天冬酰胺和谷氨酰胺的脫酰胺化均設(shè)為可變修飾。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）均調(diào)整為＜1%，肽段的最低分?jǐn)?shù)設(shè)置為＞40。

1.3.7 生物信息學(xué)分析

GO注釋蛋白質(zhì)組來源于UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.ac.uk/GOA/）。InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）將用作某些未注釋蛋白質(zhì)的替代軟件。通過GO注釋將蛋白質(zhì)分為3 類：生物過程、細(xì)胞成分和分子功能。KEGG數(shù)據(jù)庫用于蛋白質(zhì)通路的注釋和富集分析。以數(shù)據(jù)庫中的所有蛋白質(zhì)為對(duì)照，檢驗(yàn)鑒定出的蛋白質(zhì)的富集程度，根據(jù)KEGG網(wǎng)站通路層級(jí)分類方法將通路進(jìn)行分類。在STRING數(shù)據(jù)庫（https://version-10-5.string-db.org/）搜索對(duì)比所有已識(shí)別的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號(hào)或序列，按照Confidence Score＞0.7（high confidence）提取得到鑒定蛋白的相互作用關(guān)系。然后，使用R包的networkD3工具（https://cran.r-project.org/web/packages/networkD3/）進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的識(shí)別可視化。對(duì)于每個(gè)類別，均采用雙尾Fisher精確檢驗(yàn)，富集檢驗(yàn)P＜0.05則認(rèn)為差異顯著。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。使用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)試方法設(shè)置為單因素方差分析，Duncan’s test作多重比較，采用雙尾Fisher精確檢驗(yàn)，P＜0.05定義為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊乳、牛乳和人乳的基本成分分析

表 1 羊乳、牛乳和人乳的基本成分Table 1 Basic components of goat milk, cow milk, and human milk%

由表1可知，3 種乳樣在基本成分含量上有較大差別，羊乳和牛乳的蛋白質(zhì)含量和礦物質(zhì)含量均顯著高于人乳（P＜0.05）。人乳的蛋白質(zhì)含量雖然較少，但是其分子質(zhì)量較高，必需氨基酸種類豐富，還含有豐富的生物活性成分，如表皮生長因子、胰島素樣生長因子1、環(huán)核苷酸及乳鐵蛋白等，能夠滿足人體生長所需；羊乳和人乳的脂肪含量較高，顯著高于牛乳（P＜0.05），其中人乳中的不飽和脂肪酸含量較高，能促進(jìn)嬰幼兒的智力發(fā)育[17]；乳糖是乳中含量最高的營養(yǎng)成分，人乳中乳糖含量最高，大約為6.92%（P＜0.05）。雖然3 種乳蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖和礦物質(zhì)含量有一定差異，但干物質(zhì)含量基本維持在12.00%以上，并且無顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)，乳中的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白是引起蛋白質(zhì)過敏反應(yīng)的2 種蛋白，與牛乳相比，羊乳中含有較低含量的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白，而這2 種過敏原在人乳中含量極低，這也是羊乳有利于緩解人體乳糖不耐受癥的主要原因[18-19]。

2.2 羊乳、牛乳和人乳中蛋白質(zhì)的鑒定

圖 1 羊乳、牛乳和人乳中鑒定出的蛋白種類韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of unique and shared proteins among goat milk,cow milk, and human milk

本研究通過UPLC-MS/MS技術(shù)，對(duì)3 種乳樣進(jìn)行非標(biāo)記性蛋白質(zhì)組研究，并且對(duì)所有鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白注釋、功能分類和功能富集分析。由圖1可知，在羊乳、牛乳和人乳中共鑒定出3 370 種蛋白質(zhì)，包括1 023 種羊乳蛋白、789 種牛乳蛋白和1 558 種人乳蛋白。其中，共307 種蛋白質(zhì)在3 種乳間共有。人乳中的蛋白質(zhì)種類明顯高于羊乳和牛乳，這可能是酪蛋白含量不同造成的，牛乳中酪蛋白含量高于羊乳和人乳，影響了某些低分子質(zhì)量蛋白的表達(dá)[20]。

2.3 乳蛋白的GO注釋

GO是表達(dá)基因及其產(chǎn)物特性的重要生物信息學(xué)分析方法和工具，解釋了蛋白質(zhì)在不同方面的生物學(xué)效應(yīng)。分別對(duì)3 種乳樣中蛋白質(zhì)的GO注釋情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

圖 2 羊乳（A）、牛乳（B）和人乳（C）蛋白質(zhì)的GO二級(jí)分類統(tǒng)計(jì)圖Fig. 2 GO secondary classification statistics of proteins in goat milk (A),cow milk (B), and human milk (C)

由圖2可知，與乳蛋白有關(guān)的生物過程主要集中在細(xì)胞過程、代謝過程、單組織過程、生理調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、定位及信號(hào)傳導(dǎo)，這些生物學(xué)過程與細(xì)胞的生長和生物學(xué)應(yīng)激有關(guān)。多細(xì)胞組織過程、細(xì)胞成分組織及合成、發(fā)育過程、免疫系統(tǒng)過程和多組織過程在牛乳和人乳中特有，而羊乳蛋白參與較少。在細(xì)胞成分分類中，牛乳蛋白主要作用于細(xì)胞和細(xì)胞器，而牛乳和人乳中的部分蛋白質(zhì)在腔上包膜和細(xì)胞連接處表達(dá)水平較高。所鑒定出蛋白的分子功能主要涉及結(jié)合功能和催化活性，其余大部分與分子結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。與羊乳蛋白相比較，部分牛乳和人乳蛋白質(zhì)的分子功能富集在分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性方面。羊乳、牛乳和人乳在GO分析的3 個(gè)類別上均有些許蛋白富集差異，但在生物學(xué)過程、作用位置及主要功能分布上整體一致。

2.4 KEGG通路富集分析

機(jī)體內(nèi)生理功能的發(fā)揮并不是某個(gè)或某幾個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)揮作用而產(chǎn)生的，而是通過相互作用于某一模塊或路徑。KEGG是連接已知分子間相互作用的信息網(wǎng)絡(luò)，如代謝通路、復(fù)合物、生化反應(yīng)。因此通過KEGG通路富集分析羊乳蛋白、牛乳蛋白及人乳蛋白的主要作用途徑。

圖 3 羊乳（A）、牛乳（B）和人乳（C）的KEGG通路富集柱狀圖Fig. 3 KEGG pathway enrichment in goat milk (A), cow milk (B), and human milk (C)

選取富集程度（-lgPval）前10的代謝通路分別作柱狀圖橫向比較，由圖3可知，羊乳蛋白中富集程度較高的代謝通路為核糖體通路（chx03010）、碳代謝通路（chx01200）和蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工通路（chx04141），牛乳蛋白中富集程度較高的代謝通路為溶酶體通路（bta04142）、吞噬體通路（bta04145）和內(nèi)吞作用通路（bta04144），人乳蛋白中富集程度較高的代謝通路為核糖體通路（hsa03010）、蛋白酶體通路（hsa03050）及蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工通路（hsa04141）。

在羊乳、牛乳和人乳3 種乳樣中，編號(hào)04141的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工通路均有較高富集程度，分別有49 種羊乳蛋白、29 種牛乳蛋白及58 種人乳蛋白參與此過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的加工過程主要包括糖基化、羥基化、?；岸蜴I形成等，其中最主要的是糖基化過程，幾乎所有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)最終均被糖基化，使蛋白質(zhì)能夠抵抗消化酶的作用，賦予蛋白質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)的功能。因此參與該通路的蛋白質(zhì)種類差異會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成過程及其生理功能的改變，從而影響不同品種乳樣中最終蛋白質(zhì)含量及生物效能。

2.5 羊乳、牛乳和人乳共有蛋白質(zhì)相互作用分析

在生物體中，蛋白質(zhì)并非孤立存在，其功能的行使必須借助于其他蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)和介導(dǎo)，這種調(diào)節(jié)或介導(dǎo)作用的實(shí)現(xiàn)首先要求蛋白質(zhì)之間有結(jié)合作用或相互作用。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)對(duì)于揭示蛋白質(zhì)功能具有重要意義。例如，高度聚集的蛋白質(zhì)可能具有相同或相似的功能；連接度高的蛋白質(zhì)可能是影響整個(gè)系統(tǒng)代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵點(diǎn)。

圖 4 羊乳、牛乳和人乳共有蛋白的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Protein-protein interaction network of goat milk, cow milk,and human milk

通過STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)羊乳、牛乳和人乳種共有的307 種蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用分析，由圖4可知，其中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分別為丙糖磷酸異構(gòu)酶1、磷酸甘油酸變位酶1、丙酮酸激酶M、磷酸甘油酸酯激酶1、果糖二磷酸醛縮酶A等，參與的關(guān)鍵通路主要為碳代謝、糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、白細(xì)胞跨內(nèi)膜遷移等。其中磷酸甘油酸變位酶1作為糖酵解通路的重要酶之一，催化糖酵解通路中3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化生成2-磷酸甘油酸，促進(jìn)葡萄糖代謝和能量生成，可作為腫瘤代謝調(diào)控的新靶標(biāo)，其抑制劑的研發(fā)受到越來越多的關(guān)注[21]。與熱休克蛋白8相互作用的蛋白質(zhì)約有7 個(gè)，參與不同的代謝通路，熱休克蛋白8是熱休克蛋白70家族的一員，可與新生多肽結(jié)合，以促進(jìn)正確折疊，熱休克蛋白8在膜蛋白包被的小泡通過細(xì)胞膜成分的轉(zhuǎn)運(yùn)中起著ATP的作用[22]。因此該蛋白可作為潛在重要標(biāo)志物繼續(xù)進(jìn)一步分析其上調(diào)或下調(diào)后對(duì)機(jī)體的影響。

3 結(jié) 論

對(duì)羊乳、牛乳和人乳3 種乳樣進(jìn)行基本成分測(cè)定，并通過非靶標(biāo)UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)3 種乳所含蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)定性分析。結(jié)果表明：3 種乳樣的基本成分含量有較大差別，羊乳和牛乳的蛋白質(zhì)含量和礦物質(zhì)含量較高，羊乳和人乳的脂肪含量較高，人乳的乳糖含量最高，干物質(zhì)含量無明顯差異；蛋白質(zhì)酶解消化后共鑒定出3 370 種蛋白質(zhì)，GO注釋分析表明，與乳蛋白有關(guān)的生物過程主要集中在細(xì)胞和代謝過程，細(xì)胞定位在腔體和細(xì)胞器上，分子功能表現(xiàn)為結(jié)合功能和催化活性；KEGG通路在3 種乳中富集程度和種類有差異，共有的高富集通路為蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工過程；蛋白質(zhì)相互作用中的共有蛋白質(zhì)主要集中在碳代謝、糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成等通路，對(duì)這些蛋白質(zhì)的功能和作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，可以為羊乳、牛乳和人乳互補(bǔ)、提高機(jī)體營養(yǎng)吸收和利用提供科學(xué)依據(jù)，并且為促進(jìn)乳品蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制的研究提供參考。