敖智廣，韋樂華，楊 蕾，李 棟，李建斌，宋良科，廖 海，茆燦泉

(西南交通大學 生命科學與工程學院，成都 610031)

黃連(CoptischinensisFranch)又名味連、雞爪連、川黃連等，為多年生草本植物，根狀莖黃色，常分枝，密生多數須根；葉基生，堅紙質，卵狀三角形，三全裂，中央裂片卵狀菱形，羽狀深裂，邊緣有銳鋸齒[1]。由于歷史及各地民間用藥習慣不同，黃連藥材的植物來源比較復雜，涉及中國黃連屬植物6個種、1個變種，分別為黃連(C.chinensis)、三角葉黃連(C.deltoidea)、云南黃連(C.teeta)、峨眉黃連(C.omeiensis)、五葉黃連(C.quinquefolia)、五裂黃連(C.quinquesecta)以及短萼黃連變種(C.chinensisvar.brevisepala)，其根莖均含有較多的小檗堿而可供藥用。目前我國2015版藥典收載的藥材黃連基源植物是黃連、三角葉黃連以及云南黃連的干燥根莖[2]。市場銷售均為人工栽培，罕有野生黃連。短萼黃連作為黃連的變種，傳統(tǒng)的形態(tài)學、性狀、顯微和理化鑒定方法，效果和準確性較差。作為湖北后河國家級自然保護區(qū)新發(fā)現(xiàn)的野生黃連物種，有必要對其進行分子水平的鑒定，以確定其基原物種。

DNA條形碼(DNA barcode)分子鑒定技術是利用基因組中一段公認的、相對較短和保守的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術，該技術幾乎不受環(huán)境、被鑒定物形態(tài)等情況的影響，可以很好地彌補傳統(tǒng)鑒定方法的不足[3-4]，以ITS2 序列為主、psbA-TrnH序列為輔的中藥材分子水平鑒定方式已經被作為中藥材DNA條形碼鑒定原則的推薦方法之一，具有操作簡易、專業(yè)技術要求不高、可批量操作、基因序列差異對比更準確，鑒定成功率高等優(yōu)勢[5-6]。DNA條形碼技術目前已經在黃芩[7]、蛇床子[8]、石斛[9]、黃花紫堇[10]、重樓[11]等多種中藥材鑒定中廣泛應用，但對黃連屬植物的研究較少。本研究以湖北后河國家級自然保護區(qū)野生黃連為研究對象，在形態(tài)學鑒定基礎上，采用ITS2和psbA-TrnH組合，對其基原進行鑒定，以期為后河保護區(qū)黃連的種質資源保護及潛在開發(fā)利用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品材料

從湖北、四川、云南等不同地區(qū)采集12份黃連及其易混偽物種，分別將其編號為sample 1-sample 12。所有采集樣本經西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授進行形態(tài)學初步鑒定，鑒定結果見表1，樣品保存于西南交通大學樣品標本室。

表1 采集樣本形態(tài)學鑒定結果

1.2 樣品DNA提取、PCR擴增和測序

分別取12份樣品干燥的葉片各50.0 mg，加入液氮研磨成粉。使用天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，確定樣品DNA純度后擴增ITS2和psbA-TrnH序列。ITS2引物堿基序列(5′-3′)為，F(xiàn): ATGCGATACTTGGTGTGAAT，R:GACGCTTCTCCAGACTACAAT。psbA-TrnH引物堿基序列(5′-3′)為，F(xiàn):GTTATGCATGAACGTAATGCTC，R:CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。擴增體系為：正反引物各1.0 μL，TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。PCR產物使用質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，然后將合格樣品交由擎科生物科技有限公司進行雙向測序，并參照《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則》[5]判斷測序峰圖質量。

1.3 序列分析、NJ系統(tǒng)發(fā)生樹構建、K2P距離計算以及ITS2二級結構預測

使用CodonCode Aligner 2.06(CodonCode Co., USA)進行序列拼接，對ITS2序列，根據Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列測序兩端5.8S和28S基因區(qū)低質量序列，獲得完整的ITS2基因間隔區(qū)序列；用ClustalX 2.1和MEGA 7.0 進行序列比對和基于K2P(Kimura 2-parameter)雙參數模型的遺傳距離分析，用鄰接法(Neighbor joining，NJ)構建ITS2序列系統(tǒng)聚類樹；對psbA-TrnH序列，根據中藥材DNA條形碼鑒定[12](http://www.tcmbarcode.cn/china/)確定psbA和trnH序列位置，使用軟件將兩段序列剪接，得到psbA-TrnH間隔區(qū)序列，在數據庫中進行序列比對。通過ITS2 Database網站[12](http//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/)的“Predict”功能進行ITS2序列二級結構預測。

2 結果與分析

2.1 物種ITS2序列差異及K2P遺傳距離分析

共得到ITS2序列共82條, 其中12條為實驗樣本, 其余下載自NCBI,具體如表2所示, 不同樣本ITS2間隔區(qū)的序列長度和GC含量差異較大。毛莨科黃連屬7個物種間ITS2序列長度基本相近，為200～208 bp，且GC堿基平均含量差異不大，為65.34%～68.78%；高山唐松草和鐵破鑼雖然也屬于毛莨科，但與黃連屬相比，ITS2序列長度存在較大差異。與屬間相比，黃連屬內保持一定的相似性。與其他易混種相比，黃連屬植株與白屈菜的ITS2序列長度最為接近，后者為209 bp；與箭葉淫羊藿的ITS2序列長度差別最大，后者為260 bp。14個物種中，樣本GC含量最高的是巖黃連，為70.91%；含量最低的是鐵破鑼，為51.42%。

表2 不同物種ITS2間隔區(qū)的序列長度和GC含量

通過ITS2序列多樣品比對，對黃連種內及其易混種間的K2P遺傳距離進行分析。結果(表3)顯示，黃連及易混種間的K2P平均遺傳距離表現(xiàn)出明顯差異，黃連種內平均K2P遺傳距離為0.017，短萼黃連種內為0.008，黃連屬間為0.051，毛莨科間為0.088，毛莨科與罌粟科間為0.462，毛莨科與小檗科間為0.479。

表3 基于ITS2序列黃連種內及其易混種間的K2P遺傳距離

4條實驗樣本(Sample1、Sample2、Sample3和Sample7)和6條NCBI下載的黃連序列(KY780696.1，KY780694.1，KY780692.1，MF096173.1，KX984000.1，KX983996.1)比對結果表明：黃連種內有9個堿基突變位點，分別是66號T-C變異，121號T-A變異，135號G-A變異，142號C-T變異，159號T-A變異，166號G-A變異，186號T-C變異, 196號C-T變異和201號A-C變異(圖1)；1條實驗樣本(湖北后河Sample12)和8條NCBI下載的短萼黃連序列(KY780746.1，KY780725.1，KY780724.1，JN862854.1，KY780747.1，KY780745.1，KY780744.1，KY780740.1)比對分析，表明短萼黃連種內有3個堿基突變位點，分別是70號C-T變異, 87號T-C/G變異以及130號A-G變異(圖2)。

(a)、(b)和(c)分別為黃連1～70、71～140、141～206位點堿基序列，其中sample 1、sample 2、sample 3和sample 7為采集樣本，其余序列下載自NCBI數據庫

(a)、(b)和(c)分別為短萼黃連1～70、71～140、141～200位點堿基序列，其中sample 12為后河采集樣本，其余序列下載自NCBI數據庫

2.2 物種psbA-TrnH序列數據庫比對結果

將12個樣本的psbA-TrnH序列，放入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中進行序列比對，自動匹配出與目標序列最為接近的物種序列及相關信息。sample 1、sample 2、sample 3、sample 7、sample 8和sample 10與數據庫中黃連最為接近，序列相似性為95.7%～98.2%；后河采集樣本sample 12與數據庫中三角葉黃連最為接近，序列相似性為97.5%，與短萼黃連相似性為93.6%；sample 4、sample 5和sample 6僅能鑒定為黃連屬，與黃連屬序列相似性為100%；sample 9與數據庫中紫堇屬最為接近，序列相似性為89.6%～96.0%；sample 11與唐松草屬最為接近，序列相似性為94.4%～100%。

2.3 系統(tǒng)進化發(fā)育樹

基于82個樣本的ITS2序列，通過鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖3所示。黃連屬及其易混偽種可以很好地區(qū)分開，整體分為3大支。峨眉黃連單獨聚為一支；短萼黃連、日本黃連、黃連和云南黃連聚為一大類；高山唐松草、五裂黃連、白屈菜、鐵破鑼、三角葉黃連、箐邊紫堇、箭葉淫羊藿以及黃疸樹聚為一大類。采集的樣本sample 1、sample 2、sample 3和sample 7和黃連聚為一支，bootstrap支持率為98%；sample 6和峨眉黃連聚為一支，bootstrap支持率為91%；后河采集樣本sample 12和短萼黃連聚為一支，bootstrap支持為90%；sample 4和sample 5和三角葉黃連聚為一支，bootstrap支持率分別為100%和66%；sample 8和sample 10與箐邊紫堇聚為一支，bootstrap支持率為99%；sample 9和sample 11單獨聚為一支。以上結果是從分子進化角度進一步對分類進行了驗證，揭示湖北后河國家級自然保護區(qū)野生黃連屬于短萼黃連。

支上數值僅顯示自展支持率≥50%

2.4 ITS2序列二級結構預測

在ITS2 database二級結構預測數據庫中選取黃連及其7個易混品種，對其ITS2二級結構進行預測, 結果見圖4。

(a)從左往右依次為黃連、巖黃連、峨眉黃連、高山唐松草；(b)從左往右依次為短萼黃連、三角葉黃連、五裂黃連、云南黃連

通過比對ITS2序列的二級結構，可以看出8個物種的ITS2二級結構較為相似，都符合具有一個主環(huán)、4個主臂、外加2個邊環(huán)的特征，且在各主臂上有著大小、長度不一的莖、環(huán)結構。1號黃連的主臂為I、II、III和V，其中臂III最長，兩個多分支環(huán)，臂上環(huán)總計17個。2號巖黃連ITS2二級結構主臂分別為I、II、III和V，其中主臂III最長，3個多分支環(huán)，臂上環(huán)結構總計16個。3號峨眉黃連主臂分別為I、II、III和V，其中臂III最長，兩個多分支環(huán)結構，臂上的環(huán)結構總計12個。4號高山唐松草主臂分別為I、II、III和IV，其中臂III最長，兩個多分支環(huán)結構，臂上環(huán)結構總計11個。6號三角葉黃連的主環(huán)明顯比其他黃連近緣物種的ITS2序列二級結構的主環(huán)大。8號云南黃連的主要結構為一個主環(huán)，外加4個不大的主臂，結構明顯區(qū)別于其他的黃連物種。云南黃連生存環(huán)境惡劣，推測其二級結構與其在片段化的居住環(huán)境中有關，云南黃連現(xiàn)已列為瀕危物種。5號短萼黃連與7號五裂黃連的主臂與其他種屬黃連的主臂不同，其他種屬黃連的主臂有較多數量的環(huán)結構和多分支環(huán)，短萼黃連的多分支環(huán)為VI環(huán)和IV環(huán)，三角葉黃連為V環(huán)，五裂黃連的多分支環(huán)為V環(huán)，且五裂黃連主臂上的環(huán)結構更多、更大。

3 討論

加拿大科學家 Paul Herbert于2003年提出了DNA條形碼技術，在生物物種分類與鑒定研究領域得到了迅速應用。該技術利用短的、標準的 DNA 序列可為動植物來源的中藥材提供快速、準確的鑒定[13]。中國藥典2015版和中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[5]指出，利用ITS2序列鑒定中藥材植物的成功率高于psbA-TrnH序列。為此，本研究對于湖北后河自然保護區(qū)野生黃連的鑒定，在形態(tài)學初步鑒定的基礎上，進一步采用了ITS2序列鑒定為主，psbA-TrnH序列鑒定為輔的策略。

經過ITS2多序列比對和K2P遺傳距離分析，可以發(fā)現(xiàn)種內遺傳距離明顯小于種間遺傳距離，屬內遺傳距離明顯小于屬間遺傳距離，科內遺傳距離明顯小于科間遺傳距離，表明了ITS2序列作為黃連屬植株主要鑒定手段是準確可靠的。劉曉光[14]認為單一的ITS、matK、trnH-psbA和rbcL 4條片段僅能將黃連屬4種1變種中的云南黃連與其他種區(qū)分開。李波等[2]研究發(fā)現(xiàn)多片段組合鑒定可以提高鑒定準確率，且能夠有效區(qū)分中藥黃連的原植物，即三角葉黃連、云南黃連和黃連。本研究12個采集樣本的7個樣本經psbA-TrnH序列數據庫比對結果，與形態(tài)學鑒定、ITS2序列鑒定結果完全一致。短萼黃連作為黃連的變種，我們也將短萼黃連ITS2序列與黃連進行比對，結果發(fā)現(xiàn)很多堿基位點存在差異，表明黃連屬間差異性顯著大于種內，ITS2序列鑒定結果可靠。研究發(fā)現(xiàn)：后河樣本sample 12通過ITS2序列鑒定，與形態(tài)學初步鑒定結果一致，均為短萼黃連；而作為輔助鑒定psbA-TrnH序列，只能鑒定其為黃連屬植株，且與三角葉黃連最為接近。這與劉曉光[14]的研究結果一致，可能是由于黃連屬植株psbA-TrnH序列保守性不如ITS2序列保守性以及測序的準確性有關。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示：短萼黃連、日本黃連、黃連和云南黃連親緣關系較近，且ITS能夠很好地區(qū)分黃連及其變種短萼黃連；而五裂黃連和三角葉黃連和其他的易混品種不能很好地區(qū)分，如果采用更多的條形碼片段組合加以鑒定，或許能夠很好地解決這一問題。同時本研究還首次針對短萼黃連在內的7個近緣物種進行了ITS2二級結構預測，并對ITS2的二級結構進行分析，以期解決更高級分類時多序列比對困難問題[15]。研究結果顯示：7個物種，短萼黃連與黃連的ITS2二級結構最為相似，與云南黃連的二級結構相差最遠，并且三角葉黃連和五裂黃連與其他黃連屬植株的ITS2結構存在顯著差異，這也可能是導致進化樹無法完全將其與巖黃連和白屈菜等易混物種區(qū)分開的重要原因。

短萼黃連和黃連同屬國家三級保護植物，在中國植物紅皮書中瀕危級別為漸危。本研究表明對于黃連及其變種短萼黃連，無論是專家形態(tài)學鑒定，ITS2序列鑒定還是psbA-TrnH序列鑒定均能起到一定的作用，而將3種鑒定方法有機結合，能夠更精準地鑒定相關物種[16-17]。成功鑒定了湖北后河新發(fā)現(xiàn)野生黃連物種為短萼黃連，不僅對湖北后河國家級自然保護區(qū)的物種發(fā)現(xiàn)與鑒定有著重要意義，而且也為保護區(qū)黃連種質資源的保護和合理開發(fā)利用提供必要的理論依據。

致謝:感謝湖北后河國家級自然保護區(qū)、中國林科院森林環(huán)保所的項目和工作支持。