李孔會(huì)，廖森泰，鄒宇曉，李 倩

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】番石榴（Psidium guajava）為桃金娘科番石榴屬植物，亞熱帶果樹，主要生長在我國廣東、廣西、海南、臺(tái)灣、福建等熱帶及亞熱帶地區(qū)［1］，其中在廣東省惠州、茂名等地區(qū)種植較多。番石榴葉是指番石榴的干燥葉子或者帶葉嫩莖，其氣清香、味澀、甘苦［2］，含有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及微量元素，且富含多酚、黃酮、多糖等活性物質(zhì)。番石榴葉作為一種天然果樹自然資源，在墨西哥、秘魯?shù)拿耖g食用歷史悠久，常用番石榴葉煎煮來治療腹瀉，預(yù)防肥胖和糖尿病等［3］。廣東省近年來加大資金和科研力量的投入，不斷引進(jìn)和培育番石榴新品種，建立番石榴種質(zhì)資源圃和標(biāo)準(zhǔn)化示范園，對(duì)現(xiàn)有番石榴品種進(jìn)行收集和保護(hù)，并推廣新品種［4-5］，當(dāng)前番石榴資源的利用主要以鮮銷果肉為主，而大量番石榴葉未得到充分利用。研究番石榴葉茶的理化特性和功能活性隨貯藏時(shí)間的變化規(guī)律，掌握番石榴葉茶不同沖泡時(shí)間的抗氧化活性，可為番石榴葉茶質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)提供參考，為番石榴副產(chǎn)物綜合利用奠定理論基礎(chǔ)。

【前人研究進(jìn)展】目前針對(duì)番石榴葉的功能性研究較多，已有研究表明番石榴葉具有抗氧化、降血糖、抗腹瀉、止血、抗癌等功效［6-10］。葉偉［6］對(duì)不同番石榴葉有機(jī)溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行測定，提出番石榴葉提取物具有開發(fā)抗氧化抗衰老藥物以及酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用前景。沈靜［7］將番石榴葉提取物作用于糖尿病小鼠，得出番石榴葉提取物可能通過上調(diào)PI3K/Akt發(fā)揮降糖作用，改善胰島素抵抗的結(jié)論。鄔亞男［3］通過混菌固態(tài)發(fā)酵，提高番石榴葉中活性物質(zhì)的含量，并與β-環(huán)糊精形成包容物，提高其水溶性及生物利用度。這些研究都為番石榴葉的加工利用提供理論基礎(chǔ)，我國一些茶廠將番石榴葉加工制成保健型茶產(chǎn)品，然而當(dāng)前尚未有文獻(xiàn)系統(tǒng)評(píng)估番石榴葉茶的功能性物質(zhì)含量及活性。

【本研究切入點(diǎn)】本試驗(yàn)以不同年份的番石榴葉茶作為研究對(duì)象，比較其香氣成分，判斷是否具有茶類產(chǎn)品的風(fēng)味成分；比較功能成分含量和活性強(qiáng)弱，以評(píng)估番石榴葉茶功能性及貯藏穩(wěn)定性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在評(píng)估不同年份番石榴葉茶的理化特性，探索貯藏過程中功能活性的變化，明確抗氧化能力最強(qiáng)的沖泡時(shí)間段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的番石榴葉茶由廣東名揚(yáng)生物科技有限公司提供，經(jīng)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所鑒定為番石榴（Psidium guajava）葉。兩個(gè)樣品分別于2018年4月、2019年4月生產(chǎn)（簡稱樣品A、樣品B），兩者加工工藝（圖1）完全相同。通過比較分析兩個(gè)樣品的理化性質(zhì)，明確番石榴葉茶的儲(chǔ)存特性和生物活性，為其在食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

試劑：福林酚試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），蘇州亞科科技有限公司；焦性沒食子酸、鄰苯三酚、鄰二氮菲、無水葡萄糖，天津市福晨化學(xué)試劑廠；抗壞血酸（VC）、苯酚，天津市大茂化學(xué)試劑廠；鹽酸（HCl）、濃硫酸（H2SO4），廣州化學(xué)試劑廠；α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），上海瑞永生物科技有限公司。以上所有化學(xué)試劑均為分析純。

儀器與設(shè)備：N-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛郎儀器有限公司；6890N Network GC System氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，安捷倫科技有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Synergy H1酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品提取 （1）固相萃?。悍袢~茶粉碎過0.425 mm篩，稱取0.3 g，加入6 mL沸水于頂空瓶中，室溫下平衡5 min，置55 ℃的水浴磁力攪拌器中，插入萃取頭吸附60 min。（2）水提取制備：參照羅思媛等［11］的方法，料液比改為1∶60，在浸泡15、30、45、60 min時(shí)，收集水提物，備用。（3）采用乙醇浸提，超聲輔助法提取多酚，具體步驟參照沈維治等［12］的方法。（4）水提醇沉法提取多糖，參考楊燁［13］的方法。

1.2.2番石榴葉茶香氣成分測定 氣相色譜質(zhì)譜條件參照胡西洲等［14］的方法，程序升溫和質(zhì)譜條件不變，分流比為20∶1。

1.2.3番石榴葉茶多酚含量測定 以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照程沁園等［15］的方法，采用福林酚法測定多酚含量。

1.2.4番石榴葉茶多糖含量測定 以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，參考彭珊珊等［16］的方法，采用苯酚硫酸法測定樣品葡萄糖的含量，計(jì)算總多糖含量。

式中，C為樣品溶液葡萄糖的濃度，μg/mL；D為樣品定容體積，mL；M為總多糖質(zhì)量，g。

1.2.5番石榴葉茶水提物抗氧化活性測定 參照符春麗等［17］的方法測定番石榴葉茶的抗氧化活性，以VC為陽性對(duì)照，各組平行測定3次，取平均值。

（1）番石榴葉茶水提物對(duì)DPPH自由基清除能力的測定：取樣品溶液2 mL、DPPH自由基溶液2 mL，充分混勻后避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度A樣品，計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中，A背景為無水乙醇代替DPPH；A空白為無水乙醇代替樣品。

（2）番石榴葉茶水提物對(duì)羥基自由基清除能力測定：取鄰二氮菲乙醇溶液1.5 mL、磷酸鹽緩沖液3 mL，混勻后依次加入FeSO4溶液1.0 mL、樣品溶液3.0 mL、雙氧水1.0 mL，混勻，37 ℃反應(yīng)1 h，于536 nm處測定吸光值A(chǔ)樣品，計(jì)算羥基自由基清除率。

式中，A損傷為無水乙醇代替樣品；A未損傷為雙蒸水代替雙氧水，無水乙醇代替樣品。

（3）番石榴葉茶水提物對(duì)超氧陰離子清除能力測定：在試管中依次加入Tris-HCl緩沖液2.25 mL、樣品溶液2 mL、鄰苯三酚0.2 mL，混勻，常溫條件下反應(yīng)30 s，加入0.5 mL鹽酸溶液終止反應(yīng)，于320 nm下測定吸光度A樣品，計(jì)算超氧陰離子清除率。

式中，A空白為無水乙醇代替樣品。

（4）番石榴葉茶水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測定：參照龍曉珊［18］的方法，以阿卡波糖為陽性對(duì)照，在96孔板中加入樣品溶液50 μL、α-葡萄糖苷酶溶液（用磷酸緩沖溶液配制） 25 μL，混勻，37 ℃反應(yīng)10 min，加入PNPG溶液（用磷酸緩沖溶液配制） 25 μL，混勻后37 ℃反應(yīng)30 min，加入碳酸鈉溶液100 μL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度A樣品，計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中，A背景為磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液；A空白為磷酸緩沖溶液代替樣品。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Miceosoft Excel軟件整理，用SPSS軟件進(jìn)行處理和單因素方差分析，用Origin軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份番石榴葉茶香氣成分的比較

通過氣相色譜質(zhì)譜檢測，樣品A中檢測到69種香氣成分，樣品B有52種，表明樣品A中的香氣成分更加豐富。經(jīng)分析，番石榴葉茶中的香氣成分可分為萜類化合物、揮發(fā)油和其他三大類，其中萜類化合物最多，如β-石竹烯、（-）-藍(lán)桉醇、α-姜黃烯等；揮發(fā)油類物質(zhì)次之，如（+）-香橙烯、香樹烯、苯甲醛等（表1）。苯甲醛是茶葉的香氣成分之一［19］，在黃茶［20］和白茶［21］中也存在，說明番石榴葉茶可作為茶葉飲用。

表1 不同年份番石榴葉茶中的主要香氣成分Table 1 Main aroma components in guava leaf tea in different years

2.2 不同年份番石榴葉茶多酚含量的比較

福林酚法為測定總多酚的常用方法，試驗(yàn)所測得的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0116X+0.0863，R2=0.9996。由表2可知，番石榴葉茶經(jīng)乙醇浸提后，樣品A的多酚含量為34.23 mg/L，樣品B的多酚含量為40.93 mg/L，樣品B中的多酚含量較樣品A多，說明茶葉在貯藏過程中，多酚類物質(zhì)發(fā)生了降解，可能與貯藏環(huán)境或多酚本身的性質(zhì)有關(guān)。

表2 不同年份番石榴葉茶中的多酚和多糖含量比較Table 2 Comparison of polyphenol and polysaccharide contents in guava leaf tea in different years

2.3 不同年份番石榴葉茶多糖含量的比較

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0081X+0.1443，R2=0.9997。由表2可知，番石榴葉茶經(jīng)水提醇沉后，樣品A的多糖含量為11.36 mg/g，樣品B的多糖含量為6.95 mg/g，可看出樣品B中的多糖含量較樣品A少，這是由于提取物為水提物，葉茶在貯藏過程中微生物參與反應(yīng)，從而水溶性多糖含量增多。

2.4 不同年份番石榴葉茶抗氧化活性的比較

在比較番石榴葉茶對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子抗氧化活性的過程中，均以VC作為陽性對(duì)照，1 mg/mL的VC對(duì)3者的清除率分別為97.26%、90.84%、98.14%。由圖2可知，兩個(gè)樣品對(duì)3種自由基均具有一定的清除能力，且樣品B的抗氧化活性高于樣品A，說明番石榴葉茶具有抗氧化活性，且以貯藏時(shí)間較短的樣品B抗氧化活性較好。

圖2顯示，不同浸泡時(shí)間茶湯對(duì)自由基的清除能力具有相同的變化趨勢(shì)，均為先上升后下降，兩個(gè)樣品的變化趨勢(shì)也相同。浸泡30 min時(shí)，樣品A、B對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子的清除能力均達(dá)到最大，對(duì)DPPH自由基的清除率分別為57.62%、60.11%，與其他時(shí)間點(diǎn)差異顯著，對(duì)超氧陰離子的清除率分別為21.83%、23.55%；浸泡45 min時(shí)，樣品A、B對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到最大，清除率分別為74.81%、93.89%。說明番石榴葉茶的沖泡時(shí)間為30～45 min時(shí)具有最強(qiáng)的抗氧化活性。

2.5 不同年份番石榴葉茶對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較

如圖3B所示，番石榴葉茶可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，樣品A和樣品B對(duì)α-葡萄糖苷酶活性均有抑制效果，抑制率分別為94.66%和79.96%，且樣品A抑制效果顯著高于樣品B；阿卡波糖（圖3A）、樣品A、樣品B對(duì)α-葡萄糖苷酶活性半抑制率（IC50）的濃度分別為1.86、0.79、1.1 mg/mL，說明番石榴葉茶對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制活性，且貯藏時(shí)間較久的樣品A抑制效果更強(qiáng)，優(yōu)于陽性藥物阿卡波糖。

3 討論

番石榴葉作為一種天然的果樹自然資源，民間常用來煎煮治療腹瀉及預(yù)防肥胖和糖尿病等［3］。莫單丹等［22］對(duì)番石榴葉炮制品進(jìn)行顯微特征、薄層色譜鑒別，測定其水分、總灰分、酸不溶性灰分以及有效成分槲皮素的含量，并以此建立了質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。已有研究表明，番石榴葉提取物的抗氧化能力與多酚及黃酮含量有關(guān)且呈線性相關(guān)，同時(shí)其中的多糖對(duì)碳水化合物水解酶具有較強(qiáng)的抑制能力［23］。番石榴葉茶因加工工藝的差異，普遍存在理化性質(zhì)不穩(wěn)定和功能性成分損失的現(xiàn)狀，然而針對(duì)番石榴葉茶開展的理化性質(zhì)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究并不多見。因此，本試驗(yàn)對(duì)番石榴葉茶中的多酚及多糖進(jìn)行提取，測定其含量，后對(duì)其抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制作用進(jìn)行測定。

香氣是人們?cè)u(píng)價(jià)茶葉的重要指標(biāo)之一，本試驗(yàn)中，番石榴葉茶的香氣成分主要為萜類化合物和揮發(fā)油物質(zhì)，與Borah等［24］所測得的番石榴葉香氣成分相似。除此之外，在番石榴葉茶中還檢測到了苯甲醛，中國茶學(xué)辭典提到苯甲醛為茶葉中的特征香氣成分之一［19］，說明番石榴葉具有向茶葉產(chǎn)品加工方向發(fā)展的潛質(zhì)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，番石榴葉茶貯藏時(shí)間越長，其多酚含量越少，多糖含量越多，推測在貯藏過程中多酚發(fā)生降解，而多糖由于微生物的參與導(dǎo)致含量增加。胡紹德等［25］對(duì)16種不同年份黑茶的多酚含量以及成分進(jìn)行研究，得到年份越久的黑茶中多酚含量越少、兒茶素含量也較低的結(jié)論，說明多酚類物質(zhì)長期儲(chǔ)存會(huì)發(fā)生降解。張佳欣［26］對(duì)不同年份茯苓茶中水溶性多糖的含量以及多糖組分的研究結(jié)果顯示，茯磚茶多糖隨著陳化時(shí)間的增加而略有增加，多糖成分中中性糖為主體成分。說明在貯藏過程中，茶葉的成分在發(fā)生變化，部分不溶性多糖因?yàn)槲⑸锏膮⑴c轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄远嗵?，以致水提物中多糖含量增加?/p>

周先榮等［27］測定2008、2012、2016年普洱茶的體外抗氧化活性結(jié)果顯示，3個(gè)年份普洱茶均具有較好的抗氧化活性，其中以2016年普洱茶多酚的抗氧化效果最佳。本試驗(yàn)測得2019年番石榴葉茶水提取的抗氧化活性較強(qiáng)，說明貯藏時(shí)間越短，茶葉中多酚的抗氧化活性越強(qiáng)。本試驗(yàn)還證明番石榴葉茶沖泡時(shí)間在30～40 min時(shí)，抗氧化活性最強(qiáng)。由于番石榴葉茶中的抗氧化物質(zhì)前期大量且快速地溶出，而后隨著時(shí)間的延長，抗氧化物質(zhì)發(fā)生氧化或者結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其活性降低。王波等［28］給予糖尿病小鼠番石榴葉水提物，結(jié)果表明番石榴葉提取物對(duì)小鼠小腸黏膜α-葡萄糖苷酶活性具有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，本研究同樣測得番石榴葉茶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用，且貯藏時(shí)間較長的樣品抑制效果較明顯。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)比較了兩個(gè)年份番石榴葉茶的香氣成分、多酚和多糖含量，探討其抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性。結(jié)果表明，番石榴葉茶中的功能性物質(zhì)在貯藏過程中有所改變，抗氧化活性以及對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率相應(yīng)發(fā)生變化；隨著泡茶時(shí)間的延長，抗氧化活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，最佳泡茶時(shí)間為30～45 min。貯藏時(shí)間較久的2018年樣品α-葡萄糖苷酶抑制活性優(yōu)于陽性藥物阿卡波糖，說明番石榴葉茶具有開發(fā)成降血糖功能性代用茶的潛質(zhì)。番石榴葉茶的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性與多酚和多糖的含量有密切關(guān)系，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。我國華南地區(qū)有著豐富的番石榴葉資源，但是利用率較低，本試驗(yàn)不僅為番石榴葉茶在食品行業(yè)的實(shí)踐應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，而且為番石榴果樹資源綜合利用提供切實(shí)可行的途徑。