伍晴，羅銀河*，王孟清，馬曉萌

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9）是一種由RNA 指導(dǎo)Cas 核酸酶對靶向基因進行特定DNA 修飾的技術(shù)［1］。CRISPR 是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。人工改造后的gRNA 與Cas9結(jié)合后，通過PAM 序列指導(dǎo)Cas9剪切DNA雙鏈，造成DNA雙鏈斷裂。

CRISPR/Cas9 只需合成一個gRNA 就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas 蛋白不具特異性。編碼gRNA 的序列不超過100 bp，因此比構(gòu)建TALENs 更簡單方便。每一對TALENs 都需要重新合成，而用于CRISPR 的gRNA 只需要替換20 個核苷酸就行。較短的gRNA 序列也避免了超長、高度重復(fù)的TALENs 編碼載體帶來的并發(fā)癥，且廉價，可操作性強［2］。

支氣管哮喘的病理機制復(fù)雜，與氣道上皮細(xì)胞損傷、T 細(xì)胞亞群的改變、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑、神經(jīng)生長因子等因素密切相關(guān)，近年來，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（Neuroendocrine-immune，NEI）網(wǎng)絡(luò)假說在哮喘發(fā)病機制研究中也逐漸得到重視。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)免疫信號蛋白4D（Sema4D）在神經(jīng)和免疫系統(tǒng)中表達(dá)且作用。在免疫系統(tǒng)中，Sema4D 在T 細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)，并調(diào)節(jié)T 細(xì)胞啟動。Sema4D 作為免疫性腦信號蛋白，參與多種免疫，在細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，對氣道重塑也有一定的促進作用［3-4］。此外，它還對巨噬細(xì)胞、DC 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞有刺激作用，并被定義為Th2 驅(qū)動的肺病理和生理學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致氣道炎癥的產(chǎn)生［5］。由此可見，Sema4D 與哮喘病理密切相關(guān)，但具體機制尚不明確。

本研究擬利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對小鼠Sema4D基因進行靶向敲除，并從基因組對小鼠進行鑒定和驗證，以期構(gòu)建Sema4D 基因敲除小鼠哮喘模型，為進一步研究Sema4D 在病毒誘發(fā)哮喘NEI 網(wǎng)絡(luò)紊亂中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所用的清潔級小鼠為C57BL/6J，體質(zhì)量20～40 g，購自賽業(yè)生物有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2018-0003。小鼠飼養(yǎng)于賽業(yè)生物有限公司SPF級實驗動物中心，恒溫恒濕，12 h 光照，12 h 黑暗，自由采食。PCR 試劑購自LongAmp 公司，Taq DNA（貨號：NEB M0323V）由Polymerase 提供，Qhick Ligase 連接酶和限制性內(nèi)切酶由NEB 提供，Trition X-100 由Amresco0694 提供，鼠尾裂解提取基因組使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（Takara 9765）：Cat#9765-1。

1.2 方法

1.2.1 靶序列的選擇

從NCBI 小鼠基因組網(wǎng)站得到Sema4D 基因（NCBI參考序列：NM_013660.4）的序列和結(jié)構(gòu)信息。分析Sema4D 基因的結(jié)構(gòu)，該基因位于小鼠13 號染色體上，發(fā)現(xiàn)了16 個外顯子，其中ATG 起始密碼子在第3 外顯子中，TGA 終止密碼子在第16 外顯子中（轉(zhuǎn)錄本：Sema4D-201 ENSMUST00000021900.13）。實驗選擇第4 外顯子作為條件敲除區(qū)域，該區(qū)域的缺失會導(dǎo)致小鼠Sema4D基因功能的喪失。見圖1。

圖1 小鼠Sema4D基因靶序列的選擇

1.2.2 Cas9/gRNA的設(shè)計

基于gRNA的設(shè)計原則，在靶位點區(qū)域共設(shè)計4條gRNA。gRNA1（matching forward strand of gene）：TATTTTGAGCCTACAGTGGGTGG；gRNA2 （matching reverse strand of gene）：TGTCTTTAACCACCCACTG?TAGG；gRNA3（matching forward strand of gene）：CG?TAATTGAGCACAAGGAGATGG； gRNA4 （matching forward strand of gene）：TAAAGACGTAATTGAGCA?CAAGG。

1.2.3 載體構(gòu)建

按照已設(shè)計gRNA 序列合成引物，合成gRNA 引物后退火，退火產(chǎn)物與基本載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂平板過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，菌落PCR 篩選陽性克隆，鑒定的陽性克隆進行測序驗證，測序正確，說明已成功構(gòu)建CRISPR載體獲得最終載體。

1.2.4 質(zhì)粒制備

準(zhǔn)備質(zhì)粒制備所需試劑及物品，載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，搖菌提取適量質(zhì)粒，質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒，測序驗證質(zhì)粒。

1.2.5 RNA的制備

準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄所需試劑及物品，PX330質(zhì)粒線性化，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒把線性化的DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA，PCR 擴增gRNA，膠回收PCR 產(chǎn)物，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒把PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成RNA，電泳鑒定轉(zhuǎn)錄的RNA 是否降解，電泳合格的RNA用RNA純化試劑盒純化，電泳鑒定純化后的RNA，純化后的RNA用于后續(xù)受精卵注射。

1.2.6 RNA注射

從交配后0.5 d的供體母鼠子宮內(nèi)獲取受精卵，安裝顯微注射設(shè)備，準(zhǔn)備所需試劑及物品，挑選形態(tài)良好、發(fā)育狀態(tài)適中的受精卵，轉(zhuǎn)移至注射皿的培養(yǎng)基內(nèi)，將待注射RNA 進行稀釋，吸入注射針，將其逐個注射入細(xì)胞核。

1.2.7 代孕鼠制備及胚胎移植

選取適齡的母鼠與結(jié)扎公鼠合籠，獲取代孕母鼠，將注射RNA 的受精卵移植入代孕母鼠的子宮內(nèi)，將代孕母鼠放在干凈的籠盒中，并保溫待其清醒后放回籠架飼養(yǎng)，受精卵移植完成，小鼠出生，待1 周齡左右剪小鼠腳趾送檢PCR，編號，3周后進行分籠。

1.2.8 F0小鼠鑒定

基因組DNA 提取，Triton X-100 和蛋白酶混合物裂解液，裂解樣品過夜，次日，高溫滅活蛋白酶，離心收集上清，作為PCR 模板，PCR 擴增及電泳檢測，膠回收PCR 片段及測序鑒定，分析測序結(jié)果，記錄陽性鼠標(biāo)號。

1.2.9 F1小鼠繁殖

陽性鼠出生滿8 周，與8 周齡鼠合籠，出生小仔放入新的籠盒，并進行編號，待1 周齡左右剪小鼠腳趾送檢PCR，進行鑒定。

1.2.10 F1小鼠鑒定

基因組DNA 提取，Triton X-100 和蛋白酶混合物裂解液，裂解樣品過夜，次日，高溫滅活蛋白酶，離心收集上清，作為PCR 模板，PCR 擴增及電泳檢測，膠回收PCR 片段及測序鑒定，分析測序結(jié)果，記錄陽性鼠標(biāo)號。

1.2.11 Southern Blot驗證

通過對F1 代動物尾部DNA 樣本的Southern Blot分析，確定正確的基因定位，Southern Blot 分析策略如下所示。

Southern Blot預(yù)期的片段大?。?/p>

5'Probe-BglII：10.76 kb-WT，2.39 kb-MT

3'Probe-SspI：4.14 kb-WT，2.70 kb-MT

Primers for 5'Probe：

5' Probe forward primer：5'-AGCAGGCAG?GTTCAGACAGGATAGA-3'

5' Probe reverse primer：5'-AACACTACCAC?CAGGGCCAAGAAC-3'

Primers for 3'Probe：

3' Probe forward primer：5'-GTCCCAGAACAT?GAGGAAGCCCTAA-3'

3' Probe reverse primer：5'-GGCTCTTTGTACGT?GCGGTCAATTA-3'

1.2.12 后代小鼠繁殖

將F1 靶向小鼠與組織特異性Sftpc-CreERT2 刪除小鼠雜交，生成F2 代小鼠，該F2 代小鼠為靶向等位基因雜合和Cre 轉(zhuǎn)基因半雜合/雜合，自交擴繁后得到F3 代純合子小鼠和雜合子、Cre+小鼠，得到F4 flox/flox，Sftpc-CreERT2 小鼠雌雄共31 只，見圖2。

圖2 擴繁后的F4代小鼠基因型

1.2.13 他莫昔芬誘導(dǎo)

Cre-ERT 位于廣譜型啟動子或組織特異性啟動子下游，他莫昔芬可以在蛋白水平激活它。將Cre-ERT小鼠與flox小鼠進行交配繁殖，再使用他莫昔芬便可以實現(xiàn)特定時間的基因敲除。小鼠腹腔注射他莫昔芬40 mg/kg，連續(xù)注射5 d。

1.2.14 RT-qPCR檢測

經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)后成功建立C57BL/6J小鼠Sema4D條件性剔除模型，取3 只誘導(dǎo)后的敲除小鼠模型、2 只flox 小鼠模型的肺組織做量化條件敲除區(qū)的基因組拷貝數(shù)表達(dá)并進行比對，本實驗以小鼠TERT基因作為參考基因，用引物進行RT-qPCR檢測，見圖3。

圖3 RT-qPCR檢測的引物設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 CRISPR載體的構(gòu)建

利用高保真度Taq DNA 聚合酶從BAC 克隆中擴增出含有同源臂（HAs）和條件敲除（CKO）區(qū)域的小鼠基因組片段，并將其與重組位點和選擇標(biāo)記一起序列組裝成靶向載體。最終確認(rèn)目標(biāo)載體被限制性內(nèi)切酶消化，下面的單位都是千堿基對（kb），見圖4。

圖4 酶切的最終載體

2.2 F1代小鼠基因型鑒定

在F0 代陽性小鼠中用胚胎測序篩選出穩(wěn)定遺傳的founder。讓founder 與同品系的野生型雜交得到F1代，提取F1 代小鼠基因組DNA，經(jīng)PCR 擴增后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，通過PCR 篩選（引物信息見圖5），F(xiàn)1動物15、16 和30 被鑒定為陽性，獲得2 雄1 雌共3 只flox雜合子（見圖6）。并對F1代小鼠進行基因組測序，其中小鼠15的測序結(jié)果見圖7。

圖5 引物信息

圖6 F1代小鼠組織DNA PCR擴增后的基因型電泳鑒定結(jié)果

圖7 F1代小鼠DNA基因組的測序結(jié)果

2.3 F1代小鼠Southern Blot結(jié)果

通過對3 只F1 代動物（15、16 和30）尾部DNA 樣本的Southern Blot 分析，確定了正確的基因定位，證實F1 代flox 雜合子構(gòu)建成功，可用于后續(xù)分析，結(jié)果見圖8。

圖8 F1代小鼠Southern blot結(jié)果

2.4 F4代小鼠PCR篩選結(jié)果

通過PCR 引物（Annealing Temperature 60.0 °C）：F1：5'-CATGTTGCCAAGCCTAATGCTC-3'，R1：5'-TTAGTGTAAGCTACCTCAATTCCCC-3' 得到F4 代flox/flox 小鼠篩選結(jié)果的結(jié)果見圖9；通過對Sftpc-CreERT2 轉(zhuǎn)基因PCR （Annealing Temperature 60.0 °C）：Sftpc-M-F：TGCTTCACAGGGTCGGTAG Sftpc-M-R：ACACCGGCCTTATTCCAAG Sftpc-W-R：CATTACCTGGGGTAGGACCA 得到篩選結(jié)果見圖10。綜上所知，經(jīng)PCR 篩選后可知F4 代flox/flox，Sftpc-CreERT2 小鼠雌雄共31 只。

圖9 F4代flox/flox小鼠PCR篩選結(jié)果

圖10 F4代Sftpc-CreERT2小鼠PCR篩選結(jié)果

2.5 Sema4D基因敲除成功后的qPCR結(jié)果

mTert 基因熔解曲線和mSema4D 基因熔解曲線見圖11，曲線上有一個單一且尖銳的峰，這表明引物具有很強的特異性，不存在非特異性條帶或二聚體。以小鼠mTert 基因為參考基因，引物mSema4D-qPCRF1/R1 進行RT-qPCR 檢測。比較CT 法，又稱2-△△CT法，用于定量mSema4D 的基因表達(dá)。尾部樣本分別以野生型樣本5-7 作為基因表達(dá)的內(nèi)對照，我們采用2-△△Ct方法分析mSema4D 條件敲除區(qū)的相對基因組拷貝數(shù)，結(jié)果顯示敲除鼠的基因拷貝數(shù)降低，說明小鼠的Sema4D 基因含量較flox 小鼠低，提示Sema4D 基因敲除成功，見表1。

表1 條件敲除區(qū)的相對基因組拷貝數(shù)

圖11 熔解曲線

3 討論

Sema4D 是軸突導(dǎo)向分子Semaphorin 第Ⅳ家族的成員之一，CD72 和Plexin-B1 是Sema4D 的兩個主要受體，分別在淋巴組織和非淋巴組織優(yōu)勢表達(dá)。高親和力的受體Plexin-B1 與Sema4D 結(jié)合可以抑制單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞中，還可通過促進組裝成熟的粘聯(lián)復(fù)合物（focal adhensions）和脯氨酸酪氨酸激酶2（Pyk2）導(dǎo)致磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和蛋白激酶1/2（Erk1/2）的激活，是促進血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的重要環(huán)節(jié)，提示Sema4D 通過PI3-K 通路可能與哮喘的氣道重塑有關(guān)［6-7］。有研究發(fā)現(xiàn)Sema4D 和肺組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2，MMP-2）、α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相同的作用趨勢，說明Sema4D可能通過使MMP-2、α-SMA表達(dá)上調(diào)，從而參與氣道重塑的形成，Sema4D 可能成為治療哮喘氣道重塑的新靶點［4］。Sema4D 廣泛分布于人體內(nèi)，在人類多種組織中都有表達(dá)，主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中。在免疫系統(tǒng)中，受體CD72 以其低親和力作用于B 細(xì)胞，對B 細(xì)胞的發(fā)育和分化起反向調(diào)控作用，Sema4D 與受體CD72結(jié)合可以消除CD72的抑制作用，說明Sema4D的參與增強、激化B細(xì)胞，提高B 細(xì)胞的聚集和生存能力［8-9］。當(dāng)前研究也顯示Sema4D 對T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫有活化作用，可以增強T 細(xì)胞應(yīng)答，也可以通過提高樹突狀細(xì)胞的活性來實現(xiàn)抗原特異性的T 細(xì)胞的進一步分化。研究表明，Sema4D 可刺激炎癥因子的產(chǎn)生，引起Th1/Th2 失衡，加重哮喘癥狀［10］。提示Sema4D 可能通過介導(dǎo)多種免疫功能參與了哮喘的發(fā)病。Sema4D 還顯示對巨噬細(xì)胞、DC、NK 細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的刺激功能，這些細(xì)胞都參與哮喘病理，可知Sema4D在過敏氣道反應(yīng)中起著關(guān)鍵的非冗余調(diào)節(jié)作用［5］。近幾年，有研究不斷發(fā)現(xiàn)Sema4D 基因與哮喘的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。哮喘發(fā)病時，Sema4D 還可促進NGF 的表達(dá)，加重哮喘發(fā)展［11］。Sema4D 可能通過刺激大鼠腦內(nèi)c-fos 蛋白的表達(dá)及SP 的釋放而進一步抑制機體HPA 軸內(nèi)分泌激素的釋放，從而加重哮喘［12］。

中醫(yī)中藥在支氣管哮喘的治療上積累了大量經(jīng)驗，有其獨特的優(yōu)勢。《丹溪心法·喘論》首將“哮喘”進行命名，把支氣管哮喘稱之為哮病。哮喘發(fā)病因素有內(nèi)因和外因，內(nèi)因為體質(zhì)特稟、正虛痰伏，外因多為外邪侵犯、氣候驟變、飲食不當(dāng)、情志刺激、活動過度等。內(nèi)因為發(fā)病基礎(chǔ)，外因為哮喘發(fā)作條件，外因作用于內(nèi)因，引動伏痰，導(dǎo)致肺失宣肅，痰氣相搏，阻塞氣道，氣道痙攣，升降失司，以致呼吸困難，喉間痰吼嘯鳴，發(fā)為哮喘。西醫(yī)機制與之對應(yīng)即為激活神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）“大網(wǎng)絡(luò)”，受病毒侵襲，損傷Th1 的保護作用，激活T 細(xì)胞，Sema4D 表達(dá)增強，Th1/Th2 平衡被打破，刺激Th2 釋放炎癥因子，使支氣管肥大細(xì)胞脫粒、組胺釋放及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，引起氣道水腫、痰液積聚，誘發(fā)哮喘。

由上可知，Sema4D與哮喘發(fā)作的中醫(yī)機制過程密不可分，要探知哮喘發(fā)病時，Sema4D 在肺部炎癥的具體發(fā)病機制，需要通過研究基因敲除技術(shù)構(gòu)建氣道上皮Sema4D表達(dá)缺失的小鼠模型。

CRISPR/Cas9 技術(shù)因其操作簡便、效率高而成為最熱門的基因編輯技術(shù)，本研究選擇小鼠Sema4D基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子附近第4 個外顯子作為敲除區(qū)域，并將gRNA、Cas9 mRNA 和含有l(wèi)oxP 位點的供體載體混合物注入受精卵移植進同品系與雄鼠交配后超排的母鼠內(nèi)。利用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的非同源末端連接途徑獲得的敲除小鼠，由于非同源末端連接DNA 修復(fù)的結(jié)果是隨機發(fā)生的，因此筆者通過PCR 及Southern Blot結(jié)果進行篩選，最終獲得3 只陽性F0 代founder 小鼠，F(xiàn)0 代雌雄小鼠之間不能相互交配，為了確保產(chǎn)生的突變并穩(wěn)定遺傳，將其與同背景的野生型小鼠進行交配，最終生產(chǎn)3 只雌雄混合的F1 代雜合小鼠。將F1 靶向flox 雜合小鼠與組織特異性Sftpc-CreERT2 工具鼠雜交，生成F2 代小鼠，該F2 代小鼠對于目標(biāo)等位基因是雜合的，而對于Cre 轉(zhuǎn)基因是陽性的。F2 代自交擴繁后得到F3 代的CKO（flox/flox，Sftpc-CreERT2）純合子雄性小鼠和flox/+、flox/flox、flox/+Sftpc-CreERT2雌性小鼠交配后，得到31 只雌雄混合的F4 代CKO（flox/flox，Sftpc-CreERT2）小鼠。再經(jīng)他莫昔芬的誘導(dǎo)敲除目標(biāo)條件基因后，qPCR 檢測mSema4D 的含量確認(rèn)目標(biāo)基因敲除成功，成功建立C57BL/6J 小鼠Sema4D條件性敲除模型。

Sema4D 基因敲除小鼠的模型的建立為研究Sema4D 表達(dá)缺失與哮喘氣道免疫炎癥的相關(guān)性提供了重要工具，也為深入研究Sema4D相關(guān)機制提供了較好的模型，對后續(xù)的中醫(yī)治療整體實驗具有重要且深遠(yuǎn)的意義。