陳 煒

（中山大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州 510080）

膀胱癌是男性第四大常見癌癥，女性第十二大常見癌癥。2019 年美國新增膀胱癌病例80 470人，死亡17 670 人［1］。大部分罹患淺表性膀胱癌的臨床病例經積極治療后預后良好，但對于晚期膀胱癌治療效果卻不佳。因此通過腫瘤早診理論上可提升該疾病的治療效果。血尿是膀胱癌最常見的癥狀，但對于膀胱癌的陽性預測值僅有8%［2］。指南推薦對血尿患者首先進行泌尿系超聲和/或CT檢查，膀胱鏡檢查和活檢是初發(fā)診斷和術后復發(fā)監(jiān)測的“金標準”［3］。膀胱癌患者中，大約有75%為非肌層浸潤性膀胱癌（Ta/T1期，NMIBC），25%為肌層浸潤性膀胱癌（T2-T4 期，MIBC）［3］。非肌層浸潤性膀胱癌通常行經尿道膀胱腫物電切術（transure?thral resection of bladder tumor，TURBt），根據不同的危險分層，術后5 年內有31%～78%患者出現膀胱腫瘤復發(fā)需再次或多次行TURBt 手術，有0.8%～45%患者因未及早發(fā)現腫瘤復發(fā)而進展為肌層浸潤性膀胱癌［4］。因此，非肌層浸潤性膀胱癌患者TURBt 術后每3～6 個月需做一次膀胱鏡檢查［3］。但膀胱鏡檢查為有創(chuàng)性檢查，有可能導致泌尿系感染、前列腺損傷、尿道狹窄等，且臨床應用受到外科醫(yī)生經驗水平及場地設備等制約，不利于腫瘤早期篩查和術后監(jiān)測。因此，研究者們致力于尋求無創(chuàng)、便捷、準確的診斷方法輔助和改進膀胱腫瘤的檢測，以期最終補充甚至取代膀胱鏡檢查。我們使用“（bladder cancer OR transitional cell carcinoma OR urothelial cell carcinoma）AND（de?tection OR diagnosis）AND urine AND（biomarker OR assay）”關鍵詞進行了MEDLINE/Pubmed 系統(tǒng)檢索，對近10 年相關臨床研究及薈萃分析進行歸納總結，對尿液檢測技術在膀胱癌無創(chuàng)診斷中的研究進展做一綜述，并介紹我們團隊在該領域的相關研究。

1 尿細胞學

從尿液或膀胱沖洗液標本中檢測脫落癌細胞是首個廣泛應用于臨床的膀胱癌無創(chuàng)診斷方法。這一方法檢測膀胱癌的特異度高達99%（95% CI：83%～99.7%）［5］，而靈敏度因腫瘤分級而異，檢測高級別腫瘤靈敏度較高（84%），低級別腫瘤靈敏度卻低至16%［6］。炎癥、上皮不典型增生以及放化療后組織改變等因素，導致其存在12%的假陽性率［7］。尿脫落細胞學對于低級別腫瘤檢測的低敏感性是其臨床應用的主要限制因素，這主要是因為低級別腫瘤具有更強的細胞間粘附性，且缺乏顯著的細胞不典型性和明確統(tǒng)一的診斷標準［8-9］。近年來一些多中心研究結果表明，即使是高級別腫瘤，尿細胞學也顯示出了比既往數據更低的靈敏度［10-11］。因此指南推薦尿液細胞學僅作為膀胱鏡的輔助手段來更準確地檢測高級別腫瘤［3］。

2 FDA 認證的尿液生物標志物檢測方法

由于尿脫落細胞學檢測靈敏度低，且閱片依賴于病理醫(yī)生的主觀經驗，容易產生偏倚。因此探索具有高敏感性及特異性，且客觀性更強的檢查方法成為膀胱癌早期診斷的研究熱點問題。隨著尿液腫瘤標記物研究的不斷發(fā)展，目前用于診斷膀胱癌的尿液腫瘤標記物層出不窮。美國食品和藥物管理（The U.S.Food and Drug Administration，FDA）認證了6 種尿液生物標志物檢查方法，用以診斷或監(jiān)測膀胱癌：定量NMP22（NMP22 BC），定性NMP22（NMP22 BladderChek），定量BTA（BTA TRAK），定 性BTA（BTA stat），熒 光 原 位 雜 交（FISH，UroVysion），熒光免疫組化（uCyt+/Immuno?Cyt），其中定性NMP22 與BTA 可做床邊檢測，其他則為實驗室檢測［12］。

2.1 核基質蛋白22

核基質蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）是構成細胞核網狀支架結構的重要成分，它在DNA 復制、轉錄以及RNA 的加工和調控基因表達等方面發(fā)揮生物功能。細胞死亡后釋放NMP 22，以可溶性復合物或片段形式存在于人尿液中。研究表明，膀胱癌患者尿中NMP 22 濃度顯著高于正常人［13-14］。根據一項薈萃分析，定量（臨界值>10 U/mL）和定性NMP22 靈敏度分別為0.69（95% CI：0.62～0.75）與0.58（95% CI：0.39～0.75），特異度分別為0.77（95% CI：0.70～0.83）、0.88（95% CI：0.78～0.94）［12］。與尿液細胞學相比，NMP22 檢測低級別腫瘤（G1）的敏感性較高（NPM22：83%；尿液細胞學：38%；P<0.05），而總體特異性較低（NPM22：68%；尿液細胞學：96%；P<0.05）［15］，引起假陽性的原因主要有以下幾種：泌尿系感染、尿路結石、近期留置尿管、腸代膀胱、其它泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤和接受器械檢查等，研究表明，當排除以上這六類原因導致血尿的病例后，NMP22 檢測膀胱癌的特異性達95.6%［16］。

2.2 膀胱腫瘤相關抗原

膀胱腫瘤相關抗原（bladder tumor antigen，BTA）試驗是采用單克隆抗體檢測尿中的補體因子H 或補體因子H 相關蛋白，它們可影響補體激活途徑，使腫瘤免受免疫攻擊，促進腫瘤生長［17］。定量（BTA TRAK）和定性（BTA stat）BTA 靈敏度分別為0.65（95% CI：0.54～0.75）、0.64（95% CI：0.58～0.69），特異度分別為0.74（95% CI：0.64～0.82）、0.77（95%CI：0.73～0.81）［12］。一項對比BTA 與尿脫落細胞學診斷效能的薈萃分析提示，BTA stat 的靈敏度和特異度分別為70%和75%，BTA TRAK 的靈敏度和特異度分別為66%和65%，而尿脫落細胞學的靈敏度和特異度分別為55%和94%［18］。尤其在檢測低級別腫瘤方面，BTA stat 顯示出了比尿脫落細胞學更高的靈敏度（分別為58%與21%）［19］。BTA 與NMP22 檢測尿路上皮癌的優(yōu)缺點及導致假陽性的因素相似，較低的特異性及較高的假陽性率成為了限制這兩者獨立應用于臨床的原因。

2.3 熒光原位雜交技術

2.4 熒光免疫組織化學染色技術

熒光免疫組化（uCyt+/ImmunoCyt）利用三種熒光單克隆抗體（M344、LDQ10 和19A211）檢測尿脫落細胞中膀胱癌特有的三種抗原，其中M344、LDQ10 是膀胱癌粘蛋白抗原，在正常尿路上皮細胞中不表達，19A211 是糖基化癌胚抗原的高分子量成分［24］。uCyt+/ImmunoCyt 的靈敏度和特異度分別為0.725（95%CI：0.683～0.765）、0.657（95%CI：0.629～0.685）［25］。檢測低級別腫瘤的敏感性為0.65（95%CI：0.47～0.80），不僅高于脫落細胞學，且高于FISH（0.42，95%CI：0.25～0.60）［12］。多項研究表明，uCyt+/ImmunoCyt 結合尿脫落細胞學顯示出了比二者單獨應用更高的靈敏性，而特異性卻遠低于脫落細胞學單獨應用［25-26］。

表1 總結了尿液細胞學及FDA 認證的六種尿液檢測方法的診斷效能。FDA 認證的這六種尿液檢測方法均顯示出比尿細胞學更高的敏感性，尤其是在診斷低級別腫瘤方面，但其特異性卻普遍低于尿細胞學檢查［12］，并且操作復雜、價格高。目前已有多種商品化的FISH 試劑盒用于臨床，但尚無足夠的臨床資料證明上述檢測方法可取代傳統(tǒng)鏡檢和尿液細胞學在膀胱腫瘤診斷中的作用。

3 新型尿液生物標志物檢測方法

由于FDA 認證的膀胱癌尿液無創(chuàng)檢測方法未能廣泛應用于臨床，研究者們致力于探索新型尿液生物標志物，包括蛋白標志物和遺傳物質相關的標志物。

表1 尿液細胞學及FDA認證的生物標志物Table 1 Cytology and FDA-approved biomarkers

3.1 蛋白生物標志物

利用質譜技術和生物信息學等技術，對比膀胱腫瘤組織和癌旁正常組織，研究者們發(fā)現了成百上千種差異性表達的蛋白［27］，其中大部分已被證實不能有效地檢測腫瘤［28］，目前只有少數蛋白具有一定診斷價值和應用前景。

生存素（survivin）能夠抑制細胞凋亡并誘導細胞增殖，調節(jié)細胞周期，支持腫瘤細胞的血管生成，有利于腫瘤干細胞存活［29］。生存素在膀胱癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且隨著腫瘤分級和分期升高而升高［30］。薈萃分析顯示生存素診斷膀胱癌的總體靈敏度和特異度分別為0.79（95%CI：0.73～0.84）、0.87（95%CI：0.79～0.92）［29］；另一薈萃分析提示生存素的靈敏度高于細胞學（生存素：0.748；細胞學：0.433），但特異度稍遜于細胞學（生存素：0.942；細胞學：0.983）［31］。

細胞角蛋白（cytokeratins，CK）作為一種中間絲，存在于所有上皮細胞，其中某些角蛋白在尿路上皮腫瘤中高表達［32］。尿膀胱癌抗原（urinary bladder cancer，UBC）檢測通過測定尿液中的細胞角蛋白8 和18（cytokeratins 8，18）的片段來檢測膀胱癌［33-35］，薈萃分析表明其總體靈敏度為0.59（95% CI：0.55～0.62），特異度為0.76（95% CI：0.72～0.80）［33］。細胞角蛋白19 片段抗原21-1（cyto?keratin fragment 21-1，CYFRA 21-1）也是一種診斷膀胱癌的生物標志物，它的總體靈敏度為0.82（95%CI：0.70～0.90），特異度為0.87（95%CI：0.84～0.90）［35］。

微小染色體維持蛋白5（MCM5）在DNA復制的起始、延伸過程中起重要作用，在正常組織中MCM5僅局限于上皮基底層的增殖區(qū)，而在尿路上皮腫瘤組織中，MCM5 可擴展到上皮全層，因此可在脫落細胞中檢測到。ADXBLADDER 是一種商用的MCM5酶聯(lián)免疫吸附方法，一項大型前瞻性研究表明ADXBLADDER 檢測膀胱癌復發(fā)的總體靈敏度為44.9%（95% CI 36.1～54），特異度為71.1%（95% CI 68.5～73.5），陰性預測值為93%（95% CI 91.2～94.5），排除非低級別pTa 腫瘤的陰性預測值高達99.0%（95% CI 98.2～99.5），提示此方法可作為排除性診斷納入NMIBC隨訪方案中［36］。

其他正在探索中的蛋白標志物包括轉錄因子BLCA-1 和BLCA-4、抗凋亡蛋白可溶性Fas（sFas）異構體、凝聚素（Clusterin）、透明質酸（HA）、纖維連接蛋白（Fibronectin）、CD44 抗原等，這些標志物均需要進一步的研究來評估和確定其臨床價值；此外，血管內皮生長因子（VEGF）、白介素（ILs）和端粒酶等蛋白在膀胱癌中的表達也顯著升高，但較低的特異性使其無法成為診斷或監(jiān)測膀胱癌的工具［7］。

據市場人士分析，近期小麥價格不斷上漲，主要原因是貿易商經營重心已轉向秋糧購銷，加之認為當前小麥價格尚未達到心理預期，出售積極性不高，導致市場供需仍顯階段性偏緊。

真核起始因子5A2（EIF-5A2）是一種對細胞增殖起重要作用的蛋白，研究表明卵巢癌、結直腸癌、胃癌都存在EIF-5A2 基因的擴增及過度表達［37］。AIB1 是核受體共活化因子SRC-1 家族成員，在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種實體癌中過度表達［38］。我團隊研究發(fā)現EIF-5A2 和AIB1 基因在膀胱癌組織中的表達較癌旁正常組織有顯著性上調，EIF-5A2 和AIB1 基因的過度表達與膀胱癌術后復發(fā)、進展存在顯著的相關性，并可作為膀胱癌患者不良預后的獨立預測因素［37-40］。此外，AIB1 和EIF-5A2 在預測上尿路移行上皮癌的預后和復發(fā)風險中也具有重要價值［41-42］。體內外實驗證實，EIF-5A2可能通過激活TGF-β1表達來促進膀胱癌細胞的侵襲性和轉移潛能；敲除內源性AIB1 可通過G1 阻滯效應抑制膀胱癌細胞株的生長與增殖［43-44］。基于以上基礎研究，我們進一步探索了EIF-5A2 和AIB1 在膀胱癌無創(chuàng)尿液診斷中的作用。研究發(fā)現，與對照組相比，膀胱癌患者尿液中EIF-5A2 和AIB1 濃度顯著增高。獨立驗證隊列中，尿AIB1 診斷膀胱癌的敏感度為80%，特異度為86%，AUC（受試者工作特征ROC曲線下面積，取值范圍在0.5 和1 之間，越接近1.0，檢測方法真實性越高）為0.827，高于NMP22（AUC：0.766）；EIF-5A2的敏感度和特異度分別為71%、74%，AUC 為0.723。為提高檢測效能，我們進一步構建了AIB1、EIF-5A2 和NMP22 聯(lián)合檢測模型，其靈敏度為92%，特異性為92%，AUC 為0.919，優(yōu)于單一生物標志物［45］。通過以上研究，我們發(fā)現EIF-5A2 和AIB1 能夠充當膀胱癌無創(chuàng)診斷的新瘤標，聯(lián)合AIB1、EIF-5A2 和NMP22 更能提高膀胱癌的診斷準確度。我團隊于2016 年申請通過了由AIB1、EIF-5A2 和NMP22 組成的用于膀胱癌非侵入式診斷的分子標志專利。

3.2 遺傳物質生物標志物

膀胱腫瘤發(fā)病涉及較多信號通路，通過檢測尿液中的遺傳物質來診斷腫瘤也成為當下探索新型腫瘤標志物的熱門方向。

成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，它的突變及過表達會過度激活RAS-MAPK，PI3K 和STAT6 等下游通路，加速細胞增殖分化及血管生成［46］。研究發(fā)現pTa、pT1 和pT2-4 期腫瘤FGFR3 突變率分別為80%、21%和16%［46-47］。FGFR3 突變用于檢測低級別腫瘤復發(fā)的靈敏度為58%［48］，對于初發(fā)血尿患者，FGFR3 診斷腫瘤的靈敏度和特異度分別為25%、99.7%［49］。對比發(fā)現，FGFR3突變檢測診斷低級別淺表性腫瘤的敏感性優(yōu)于尿脫落細胞學，與細胞學聯(lián)合診斷時，靈敏度高達86%［50］。

Cxbladder 方法通過檢測膀胱癌患者尿液中顯著升高的4 種mRNA（IGFBP5，HOXA13，MDK，和CDK1）及與良性炎癥病變相關的1 種mRNA（CXCR2）來診斷膀胱癌［51］。研究表明［52］，當通過調整閾值，使其檢測特異度達85%時，Cxbladder 檢測初發(fā)膀胱癌的靈敏度為82%。與細胞學及NMP22相比，Cxbladder 具有更高的靈敏度和陰性預測值，在監(jiān)測膀胱癌復發(fā)方面具有比其他兩者更高的效能［11］。

端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcrip?tase，TERT）是端粒酶的活性組分及限速步驟，TERT 基因啟動子突變參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［53］。膀胱癌TERT 的突變率超過70%，其診斷初發(fā)和復發(fā)膀胱癌的靈敏度分別為62%、42%，特異度分別為90%、73%［54］。

極光激酶A（aurora Kinase A，AURKA）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與Wnt 等重要的細胞信號通路，直接或間接地調節(jié)一些重要蛋白的表達，與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［55］。定量檢測尿液AURKA mRNA 診斷膀胱尿路上皮癌的敏感性為83.6%，特異性為65.2%。與Ta 相比，T1 和T2 期的AURKA 表達分別增加了9.31 倍和4.78 倍；高級別腫瘤的AURKA 表達水平比低級別腫瘤高5.33倍。研究結果還提示，AURKA 和尿細胞學總體AUC 相似（0.744 和0.721，P=0.588）。AURKA 檢測低級別腫瘤更準確，而細胞學診斷高級別病變更準確［56］。

微小RNA（micro RNA，miRNA）在RNA 沉默和基因表達轉錄后調控發(fā)揮作用，越來越多的證據表明，異常表達的miRNAs 可以作為惡性腫瘤的癌基因或抑癌基因［57］。多種miRNA 可在膀胱癌患者的尿液中被檢測到，它們的總體靈敏度為71%-94%，特異度為51%-100%，AUC 為73%-92%［13］。其中，檢測膀胱癌效能較高的單一miRNA 有miR?NA-155（靈敏度80.2%，特異度84.6%）［58］、miRNA-125-b（靈敏度84.8%，特異度76.2%）［59］、miRNA-99-a（靈敏度74.1～78%，特異度82.6～85.7%）［59-60］及miRNA-96（靈 敏 度71～72.3%，特 異 度88.9～89.2%）［61-62］。多種miRNA 聯(lián)合檢測可進一步提高診斷效能，miRNA-99-a/125-b 聯(lián)合檢測膀胱癌靈敏度為86.7%，特異度為81.1%［59］，6種miRNA（187/18a/25/142-3p/140-5p/204）聯(lián)合檢測的靈敏度為84.4%，特異度為86.5%［63］，而25 種miRNA 聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度分別高達87%、100%［64］。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，ln?cRNA）通過與基因組DNA、mi RNA、m RNA 和蛋白質的相互作用來發(fā)揮功能，參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移等過程［65］。lncRNA 檢測膀胱癌的總體靈敏度和特異度分別為0.73（95% CI：0.58～0.84）、0.78（95% CI：0.62～0.89）［66］。其中研究較多的為UCA1，一項納入6 項研究的薈萃分析表明，尿液UCA1 診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為0.81、0.86［67］。另一項研究使用2 種lncRNA（uc004cox.4/GAS5）聯(lián)合檢測，其診斷膀胱癌靈敏度為84.5%，特異度為78.2%，AUC 為0.885［68］；3 種尿液外泌體來源的lncRNA（MALAT1/PCAT-1/SPRY4-IT1）聯(lián)合診斷膀胱癌靈敏度為62.5%，特異度為85.0%，AUC為0.813［69］。

DNA 甲基化是一種基因表觀遺傳調控方式，一些尿高甲基化標記物已經被用于膀胱癌的檢測。有研究者檢測了膀胱癌患者和健康人群尿液DNA甲基化的水平，并建立了一個由150 個CpG 位點組成的膀胱癌檢測生物標記物模塊（UroMark），在后續(xù)的驗證試驗中，UroMark 的靈敏度、特異度和陰性預測值分別為98%、97%、97%［70］。但一篇薈萃分析顯示，各驗證試驗間的結果差異性很大，靈敏度為52%～100%，特異度為0～100%［71］。

此外，在遺傳物質生物標志物方面，還有DNA微衛(wèi)星/雜合性缺失檢測、XPERT BC Monitor（檢測尿液5 種mRNA）和拓撲異構酶IIα（Topoisomerase-II alpha，TopoIIA）基因過表達檢測等［7，13，72］。

上述遺傳物質相關的生物標記物在膀胱癌中的研究時間短，各試驗結果差異性大，需要進一步的前瞻性研究來驗證其在膀胱癌診斷和監(jiān)測中的作用。表2 總結了一些重要新型生物標志物的檢測效能。

3.3 其他新型無創(chuàng)尿液檢測方法

拉曼光譜是一種激光照射在物體上發(fā)生非彈性散射光線組成的光譜。近期，研究者們嘗試將拉曼光譜化學尿液分析方法（Rametrix?）應用于膀胱癌診斷中。當使用尿液中22 種主要成分來建立模型時，Rametrix?檢測膀胱癌的準確率為80.4%，敏感性為82.4%，特異性為79.5%［73］。電子鼻（eNose）是一種模擬人類嗅覺系統(tǒng)的儀器，它可以嗅出人類排泄物（尿液、呼吸和糞便）散發(fā)出來的氣體和蒸汽，用于診斷各種疾病。一項研究表明，電子鼻診斷膀胱癌的靈敏度及特異度分別為60.8%、90.2%，AUC 達0.909［74］。另一項研究利用熒光光學傳感器檢測尿液揮發(fā)性有機化合物，利用24 個傳感器點陣列來診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為84.21%和87.80%，此外，該方法鑒別高、低級別膀胱癌的敏感性為66.67%，特異性為75.00%［75］。新型無創(chuàng)尿液診斷方法層出不窮，與光學等技術結合更是大勢所趨，目前，此方面的研究尚處于單中心小型試驗探索階段，隨著技術與儀器的發(fā)展，可開展更多大型研究進一步驗證其膀胱癌診斷價值。

4 結論

本文歸納總結了現階段通過尿液來進行膀胱癌無創(chuàng)診斷的檢測方法，其中FDA 認證的6種檢測方法均具有較低的特異性，不足以取代傳統(tǒng)膀胱鏡檢查、活檢及尿液細胞學在膀胱癌診斷中的作用；新型尿液生物標志物檢測方法包含了蛋白標志物和遺傳物質相關標志物等，我團隊通過研究發(fā)現EIF-5A2 和AIB1 能夠充當膀胱癌無創(chuàng)診斷的新瘤標，聯(lián)合AIB1、EIF-5A2 和NMP22 更能提高膀胱癌的診斷準確度。

表2 新型尿液生物標志物Table 2 Novel urinary biomarkers

尋找無創(chuàng)、便捷、準確的膀胱癌診斷方法仍任重道遠，一項調查顯示，如果尿液試驗靈敏度低于90%，89%的患者仍將選擇膀胱軟鏡作為早期膀胱癌術后監(jiān)測方法［76］。未來研究者們除了繼續(xù)探索新的尿液生物標志物外，也可通過多種膀胱腫瘤標志物或多種技術的的聯(lián)合應用提高診斷的靈敏度及特異性，并且需對有潛力的新型生物標志物展開進一步更大規(guī)模的前瞻性驗證研究。