張 波, 陳佳琛, 崔夢瑤, 劉珂軼, 張安龍

(陜西科技大學環(huán)境科學與工程學院， 西安 710021)

微藻是一類在自然界中分布廣泛的微生物，具有較強的適應性，因其可高效吸收氮磷營養(yǎng)及較高的化學需氧量(chemical oxygen demand,COD)去除率而被應用于廢水處理。常見的用于廢水處理的微藻種類主要有綠藻門的小球藻(Chlorella)[1-3]、柵藻(Scenedesmus)[4-6]、衣藻(Chlamydomonas)[6-7]和藍藻門的螺旋藻(Spirulina)[8]、顫藻(Oscillatoria)[9]等。許多研究表明，微藻可用于各種廢水的處理，如工業(yè)廢水[4-5]、市政污水[10]、農(nóng)業(yè)廢水[1]等。利用廢水培養(yǎng)微藻可在廢水凈化的同時積累微藻生物量，用于生物柴油、生物飼料等領域，大幅降低微藻的培養(yǎng)成本，進而實現(xiàn)廢水的無害化處理與資源化利用。

制漿造紙工業(yè)是中國國民經(jīng)濟支柱性產(chǎn)業(yè)之一，給中國帶來了巨大的經(jīng)濟收益，但造紙生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的造紙廢水給水生態(tài)環(huán)境帶來了巨大的壓力。造紙廢水具有排放量大、各段廢水成分復雜、處理難度大等特點。經(jīng)過一級物化、二級生化處理后仍不能達到排放標準。近年來，芬頓高級氧化技術多被應用于造紙廢水三級深度處理，然而其反應條件窄、藥劑成本高、二次污染嚴重等問題限制其更廣泛的應用[11-12]。相比之下，藻菌共培養(yǎng)體系用于造紙廢水三級深度處理具有顯著優(yōu)勢，其處理成本低、效果好且獲得的微藻生物質可進一步加工制備高附加值產(chǎn)品，提高經(jīng)濟效益。利用藻菌共生體系處理廢水技術具有巨大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益，是深度處理造紙廢水的一種很有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g。

近年來，關于建立藻菌共生體系以提高微藻生物量、油脂產(chǎn)率和污水處理效率的研究已有一定的進展。衛(wèi)治金等[13]在缺氮條件下將無菌小球藻與細菌以不同初始比例共培養(yǎng)，結果表明，在小球藻與固氮菌70∶1(V/V) 共培養(yǎng)體系中，其生物量和油脂含量分別較單獨小球藻培養(yǎng)時提高了66.3%和47.7%。Bashan等[14]采用小球藻和巴西固氮螺菌(Azospirillum) 組成的藻菌共生體系用于處理城市污水，其氨氮、硝酸鹽氮和磷的去除效率分別達到100%、15%和36%，顯著高于純藻系統(tǒng)的處理效果。Liang等[15]研究了地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) 與普通小球藻(Chlorellavulgaris) 共培養(yǎng)去除污水中氨氮，當藻/菌細胞密度比為1∶1時，氨氮的去除率顯著提高到78%，而在相同條件下，單藻系統(tǒng)中氨氮的去除率為63%。Zhou等[16]利用小球藻和曲霉菌獲得的人工藻菌共生體進行廢水處理，對氨氮、總氮、總磷和化學需氧量的去除率分別為100%、58.85%、89.83%、62.53%(濃縮液) 和23.23%、44.68%、84.70%、70.34%(稀釋豬糞廢水)。這些研究表明，藻菌共生體系可以有效提高微藻的生物量及油脂產(chǎn)量，同時將其應用于廢水處理中具有良好的COD及氮磷去除效果，具有良好的應用前景。

綜上，藻菌共生體系處理廢水的可行性已得到廣泛認可，但目前的研究大多是利用藻菌共生體系處理市政污水以及畜禽養(yǎng)殖業(yè)廢水等，對于造紙廢水處理的相關研究甚少；且已有研究大多是通過在微藻培養(yǎng)體系中外源添加某類功能細菌來實現(xiàn)共生體系的構建，而對于微藻生長過程自然形成的微生態(tài)體系中大量存在的細菌對微藻生長的影響研究并不系統(tǒng)。現(xiàn)將從棕鞭藻自養(yǎng)培養(yǎng)體系分離篩選出對微藻生長具有顯著促進作用的微藻共棲細菌，通過確定最佳的藻菌投加比例以優(yōu)化藻菌共生體系，并探究其對造紙廢水的處理效果。以期為揭示微藻共棲細菌對藻細胞生長代謝的影響以及藻菌共生體系在造紙廢水深度處理的應用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 廢水來源與分析方法

實驗所用造紙廢水來源于陜西某造紙廠二沉池出水，經(jīng)紗布過濾除去懸浮固體物后測定其水質?？偟涂偭诐舛确謩e采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[17]與鉬酸銨分光光度法[18]測定；COD采用連華科技5B-6C多參數(shù)水質測定儀測定；色度采用恩帆EFS-3D色度測定儀測定。造紙廢水水質指標如表1所示。

1.2 微藻的來源與培養(yǎng)

棕鞭藻屬(Ochromonassp. MN028526) 分離自陜西科技大學人工湖。利用BG11培養(yǎng)基[19]培養(yǎng)棕鞭藻，取BG11培養(yǎng)基100 mL并置于250 mL三角瓶中，接種藻株至棕鞭藻培養(yǎng)液OD540為0.2。將棕鞭藻培養(yǎng)液于光強3 000 lx、溫度28 ℃、光周期L∶D=14 h∶10 h、搖床轉速150 r/min的條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.3 棕鞭藻共棲細菌分離、培養(yǎng)與鑒定

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的棕鞭藻培養(yǎng)液用無菌水以1∶10的比例逐級稀釋，取100 μL稀釋至10-4～10-6的稀釋液，涂布至LB培養(yǎng)基(蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 5 g/L、氯化鈉 10 g/L) 中，分離棕鞭藻的共棲細菌。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中2～3 d，分離不同的菌落，多次劃線培養(yǎng)直至獲得單一、純凈的菌落。

利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離獲得的共棲細菌，培養(yǎng)至穩(wěn)定期后1 000g離心，獲得菌株。利用細菌基因提取試劑盒(Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒) 提取細菌DNA。利用已提取的基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCGA-3′) 和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 進行PCR擴增[20]。PCR反應體系(25 μL) 為Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，加純水補充至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性3 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，29個循環(huán)；循環(huán)結束后72 ℃延伸5 min，最后12 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)核酸染料染色后用凝膠成像系統(tǒng)進行驗證，使用膠回收試劑盒對混合后的PCR產(chǎn)物進行切膠純化，將純化產(chǎn)物進行細菌宏基因組16S rDNA測序，測序區(qū)間為V3～V4可變區(qū)，測序平臺為Illumina MiseqTM，委托生工生物工程有限公司完成。將測序獲得的16S rRNA序列上傳至NCBI網(wǎng)站，進行BLAST比對(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)，然后用MEGA7.0構建進化樹。

1.4 構建棕鞭藻與細菌的共培養(yǎng)體系

將分離獲得的細菌與微藻共培養(yǎng)，進一步研究細菌對微藻生物量積累的影響。將棕鞭藻與分離獲得的細菌分別培養(yǎng)至對數(shù)期，8 000 r/min離心5 min后棄上清，按比例取適量加入到BG11培養(yǎng)基或廢水中振蕩培養(yǎng)。

1.5 棕鞭藻細胞葉綠素a含量的測定

取棕鞭藻藻液5 mL，10 000g離心5 min，棄上清；并將微藻細胞懸浮于5 mL 90%的甲醇溶液，75 ℃水浴5 min后，10 000g離心10 min。將上清液取出，以90%甲醇為對照，檢測相應吸光度D(λ)(λ為波長)，再計算樣品中葉綠素a的濃度(CChla)[21]，計算公式為

CChla=16.82D(665)-9.28D(652)

2 結果與分析

2.1 棕鞭藻共棲細菌的分離

經(jīng)平板多次劃線篩選出5株細菌，編號為A～E(表2)。A、B、E三株細菌菌落為球形，表面光滑，邊緣整齊，菌落顏色分別為橙紅色、白色、乳白色；C菌落呈現(xiàn)扁平狀，表面粗糙，邊緣褶皺，為淡黃色；D菌落呈球形，表面光滑，邊緣整齊，乳白色。

表2 不同菌群形態(tài)Table 2 Morphology of different bacterial

2.2 棕鞭藻共棲細菌的鑒定

經(jīng)平板多次劃線篩選出5株細菌，將5株共棲細菌16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast對比，5株共棲細菌分別與卟啉桿菌屬(Porphyrobactersp.)、生絲單胞菌屬(Hyphomonassp.)、水單胞菌屬(Aquimonassp.)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriumsp.)，噬氫菌屬(Hydrogenophagasp.) 高度相似，進一步構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

圖1 棕鞭藻伴生細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of associated bacteria of Ochromonas

2.3 共棲細菌對微藻生長的影響

將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的棕鞭藻與5株共棲菌分別以1∶1比例接種至BG11培養(yǎng)基，共培養(yǎng)10 d，監(jiān)測每天微藻葉綠素a濃度(圖2)。結果表明，在前4 d，除菌株D農(nóng)桿菌對微藻生長有抑制外，其他4組長勢基本相同；5 d后水單胞菌對微藻的生長開始出現(xiàn)明顯的促進作用，其他3株菌仍無較大影響。在5株共棲菌中，菌株C水單胞菌屬促微藻生長效果明顯，微藻葉綠素a含量在第10 d達到5.236 mg/L，比對照組葉綠素a含量增加了43.57%，此時微藻干重達到0.513 g/L。菌株D農(nóng)桿菌屬對棕鞭藻的生長有抑制作用，菌株A、B、E對棕鞭藻的生長效應作用不明顯。據(jù)此，篩選出促進微藻生長的優(yōu)勢促生菌株C菌種，即水單胞菌，用于棕鞭藻藻菌共生體系的構建。

圖2 5株伴生菌對棕鞭藻生長的影響Fig.2 Effect of five bacteria on the growth of Ochromonas

2.4 棕鞭藻與水單胞菌共生體系的建立

建立棕鞭藻與水單胞菌共生體系，將藻菌以不同比例(10∶1、2∶1、1∶1、1∶3、1∶5) 配比接種至BG11培養(yǎng)基，共培養(yǎng)10 d，監(jiān)測其每日的葉綠素a變化情況。結果如圖3所示，可知葉綠素a含量總體出現(xiàn)先增高后逐漸平穩(wěn)的趨勢；與對照組相比可以看出，在這5種比例只要加入水單胞菌，就會對微藻的生長產(chǎn)生促進作用，且隨著藻菌比的減小促進作用出現(xiàn)先增高后降低的趨勢。當藻菌比為1∶3時，葉綠素a含量增長最快，說明在這個比例下細菌對微藻的促進作用最高；在第10 d時，葉綠素a含量達到7.975 mg/L，高出對照組葉綠素a含量112.23%，此時微藻產(chǎn)量干重為0.78 g/L。據(jù)此，選用棕鞭藻與水單胞菌以1∶3建立藻菌共生體系用于對造紙廢水處理的研究。

圖3 藻菌比對棕鞭藻葉綠素a含量的影響Fig.3 Effect of the ratio of algae to bacteria on the content of chlorophyll a in Ochromonas

2.5 造紙廢水對微藻生長的影響

將造紙廢水用不同比例純水稀釋(分別為原水、稀釋2倍廢水和稀釋5倍廢水)，滅菌后接入微藻培養(yǎng)物或藻菌共生培養(yǎng)物，培養(yǎng)8 d測其每日葉綠素a濃度。由圖4(a) 可知，微藻葉綠素a總體變化趨勢相似，在稀釋2倍廢水培養(yǎng)的藻菌共生體系中葉綠素a含量始終保持最佳，在培養(yǎng)第8 d時，葉綠素a含量高達10.952 mg/L，此時體系中微藻干重為1.073 g/L。從圖4(b) 中可以看出，相較于其他稀釋倍數(shù)，當造紙廢水稀釋2倍時，純藻和藻菌共生體系中的微藻的生物量積累均處于更高的水平。與未經(jīng)稀釋的廢水體系相比，純藻和藻菌共生體系中微藻的葉綠素含量在第8 d分別高出36%和34.33%。結果說明稀釋2倍的造紙廢水中氮磷等營養(yǎng)條件更適宜微藻的生長，在該稀釋度下廢水中總氮、總磷濃度大約為11.21 mg/L和2.45 mg/L。需要特別指出的是，除純藻和藻菌共生體系在稀釋5倍廢水比生長速率基本相等外，其余兩組微藻在藻菌共生體系生長比純藻系統(tǒng)好，說明藻菌之間形成了良好的共生作用，此時細菌給棕鞭藻提供CO2進行光合作用，同時細菌吸收棕鞭藻產(chǎn)生O2及其他有機物。

圖4 不同廢水稀釋度下藻菌生長情況Fig.4 Growth of algae and bacteria under different dilution of wastewater

2.6 藻菌共生體系處理造紙廢水的效果

為對比純藻、藻菌共生和純菌體系對造紙廢水的處理效果，將造紙廢水用純水稀釋2倍，滅菌后分別接入微藻培養(yǎng)物、藻菌共培養(yǎng)物和細菌培養(yǎng)物，培養(yǎng)8 d后計算體系內(nèi)COD、總氮量(total nitrogen,TN)、總磷量(total phosphorus,TP)及色度的去除效率。由圖5可知，藻菌共生體系對造紙廢水COD、TN、TP和色度的去除能力都顯著優(yōu)于純藻和純菌體系。藻菌共生體系對廢水COD的去除率達到75.67%，較純藻體系(去除率為63.13%) 和純菌體系(去除率為59%) 提高了近1.3倍；相較于前期課題組使用的芬頓法，去除造紙廢水COD效果相當[22]，使用藻菌共生體系處理造紙廢水可大幅降低處理成本和提高環(huán)境效益，且微藻可用于后續(xù)生物柴油的開發(fā)利用，實現(xiàn)良好的經(jīng)濟價值。

對于TN的去除，相較于純藻體系(去除率為22.24%) 和純菌體系(去除率為28.53%)，藻菌共生體系中TN去除率可達到35.19%；純菌對TN的去除效率較純藻高，說明廢水體系中細菌對N源的吸收利用是影響藻菌共生體系處理總氮效率的關鍵因素之一。

圖5顯示單獨的細菌處理TP的去除率為30.96%，純藻體系和藻菌共生體系處理可使得TP去除率升高至75.21%和90.2%。這一結果可能是由于微藻不但可以直接吸收和利用無機鹽，還可以提高水中溶解氧濃度，促進細菌的生長，從而加強有機質分解，降低水中氮磷含量。因此，藻菌協(xié)同作用可以顯著促進棕鞭藻對廢水中氮磷等的吸收。由圖5(b)可看出，藻菌共生體系對造紙廢水色度的去除能力顯著，處理8 d后，去除率高達93.45%。

圖5 不同體系對造紙廢水中COD、TN、TP色度去除效果Fig.5 Removal effect of different systems on COD, TN, TP and chroma in papermaking wastewater

3 結論

(1)分離純化獲得棕鞭藻(Ochromonassp. MN028526) 5株伴生細菌，經(jīng)16S rDNA基因測序，5株菌株分別為Porphyrobactersp.(卟啉桿菌屬)、Hyphomonassp.(生絲單胞菌屬)、Aquimonassp.(水單胞菌屬)、Agrobacteriumsp.(農(nóng)桿菌屬) 和Hydrogenophagasp.(噬氫菌屬)。

(2)水單胞菌(Aquimonassp.) 能明顯促進微藻葉綠素a含量的增長，對微藻生物量積累促進率可達43.57%。農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriumsp.) 對棕鞭藻的生長有抑制作用，卟啉桿菌(Porphyrobactersp.)、生絲單胞菌(Hyphomonassp.)、噬氫菌(Hydrogenophagasp.) 對棕鞭藻無顯著影響。且當棕鞭藻與水單胞菌的初始接種比例為1∶3時，細菌對微藻的促進作用最佳，微藻干重最高可達0.78 g/L。

(3)水單胞菌與棕鞭藻藻菌共生體系對造紙廢水中COD、TN、TP及色度的去除效果顯著優(yōu)于純藻和純菌處理體系，去除率最高分別達75.67%、35.19%、90.2%和93.45%。