高媛惠，馬林峰，霍乃蕊

（1.太原海關技術中心，山西太原 030024；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷 030801）

細胞融合是指2 個或2 個以上的親代細胞通過細胞膜融合，細胞質混合，甚至細胞核融合后形成雜交細胞的現(xiàn)象，形成的子代細胞將兼具親本細胞的表型[1]。細胞融合可自然發(fā)生[2]，也可在體外通過促融劑來制備融合子。作為細胞生物學的一項核心技術[3]，細胞融合技術在科學研究、動植物育種[4]、單克隆抗體[5-7]、疫苗、藥物[8]制備和研發(fā)中廣泛應用。菌體細胞融合之前需要制備成沒有細胞壁的原生質體，原生質體融合時，2 個親株整套基因發(fā)生接觸、交換和組合，得到多種類型的重組子，從而可獲得性能優(yōu)良的菌株[9]。原生質體融合技術是21 世紀初發(fā)展起來的基于全基因組的定向微生物菌種改良技術[10]，廣泛用于食品添加劑[11]、藥物[12]、食用菌[13]等的生產(chǎn)及生物治污。

本研究采用單因素試驗考察菌齡、溶菌酶濃度、酶解溫度和時間對原生質體形成率和再生率的影響，并以原生質體形成率為指標，通過正交試驗優(yōu)化原生質體制備工藝，旨在優(yōu)化嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的原生質體制備工藝來獲得融合子，為產(chǎn)芽孢乳酸菌的育種和改良提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BL20386 無毒菌株從整腸生膠囊（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司）中分離純化。

1.2 試劑與儀器

檸檬酸三銨（天津市化學試劑六廠）、順丁烯二酸（北京奧博星生物技術有限責任公司）、吐溫-80（天津市風船化學試劑科技有限公司）。溶菌酶（sigma，活力為4 000 U/g）溶液為200 U/mL，過濾除菌-20 ℃儲存?zhèn)溆?。MRS 培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基、CMR培養(yǎng)基（地衣芽孢桿菌高滲再生培養(yǎng)基）、乳酸菌原生質體再生培養(yǎng)基、HMM（高滲MM）培養(yǎng)基、原生質體穩(wěn)定液（SMM）均按文獻[14]配制。

數(shù)字酸度計（PHS-25C，上大普儀器有限公司）；可見分光光度計（WFJ2100，尤尼柯儀器有限公司）；usb 數(shù)碼成像顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 酶解前活菌計數(shù) 嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的活化菌種以0.5%（體積比）分別接種到MRS培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期中期，取1.5 mL 離心收集菌體（3 500 r/min，10 min），生理鹽水洗滌2 次，用1.5 mL SMM制成菌懸液。取0.1 mL菌懸液，生理鹽水稀釋并平板計數(shù)。地衣芽孢桿菌采用涂布法，乳酸菌采用澆注法或雙層瓊脂法，將稀釋至10-5時的菌數(shù)計為A。

1.3.2 原生質體制備 菌懸液中加入適量溶菌酶，42 ℃水浴恒溫酶解，期間每隔20 min 取樣一次，并用0.5 mol/L 蔗糖液制片，結晶紫染色鏡檢，大部分菌體形成球形原生質體后停止酶解，進行原生質體計數(shù)。離心收集原生質體（3 500 r/min，15 min），并用高滲液洗滌除酶，懸浮于高滲緩沖液（0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 值6.0）中加入0.8 mol/L 甘露醇）備用。

1.3.3 裂解計數(shù) 取0.1 mL 酶解后的菌液，離心收集菌體并用PBS 溶液洗滌，蒸餾水稀釋至10-5，分別涂布于CM和MRS 平板上計數(shù)，菌落數(shù)記為B，代表未脫壁菌數(shù)。等量吸取酶解后的菌液，用高滲緩沖液稀釋至10-5，在再生培養(yǎng)基平板上計數(shù)，菌落數(shù)計為C，代表再生平板上的總菌數(shù)。

1.3.4 原生質體制備工藝的優(yōu)化 分別收集培養(yǎng)8、12、16、18 h 的嗜酸乳桿菌菌液及培養(yǎng)4、6、8、10 h的地衣芽孢桿菌菌液，以5 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解4 h，考察菌齡對原生質體形成率和再生率的影響。

將嗜酸乳桿菌對數(shù)生長期菌體分別用1、5、10 mg/mL 的溶菌酶37 ℃酶解4 h，地衣芽孢桿菌則分別用0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解4 h，考察酶濃度對原生質體制備的影響。

對數(shù)生長期嗜酸乳桿菌用5 mg/mL 溶菌酶分別酶解30、40、50 min，地衣芽孢桿菌用2.0 mg/mL的溶菌酶處理，每隔1 h 取樣分析，考察酶解時間對原生質體制備的影響。

分別在30、37、42 ℃下用5 mg/mL 溶菌酶酶解嗜酸乳桿菌40 min，分別在25、37、40、42 ℃酶解地衣芽孢桿菌4 h，考察酶解溫度對原生質體形成率和再生率的影響。

根據(jù)單因素試驗結果，進行正交試驗，各因素所設水平如表1 所示。

表1 嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌原生質體制備的因素水平

1.3.5 原生質體融合 分別取0.1 mL 懸浮在高滲緩沖液中的嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌原生質體，加0.9 mL 40%的PEG6000，混勻，室溫下放置2 min融合，加1.5 mL 高滲緩沖液，離心收集沉淀，洗滌2 次，適當稀釋后涂布于HMM平板，37 ℃培養(yǎng)7 d，菌落計數(shù)為D。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗采用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)整理與作圖。

2 結果與分析

2.1 菌齡對原生質體形成率與再生率的影響

由圖1 可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，原生質體形成率呈下降趨勢，再生率呈先升高后下降。在對數(shù)生長期中期，嗜酸乳桿菌培養(yǎng)8～12 h，地衣芽孢桿菌培養(yǎng)4～8 h，原生質體形成率較高；對數(shù)生長末期，嗜酸乳桿菌（16 h）和地衣芽孢桿菌（8 h）的再生率最高，隨后快速下降，故選擇對數(shù)生長中期的菌體可兼顧較高的原生質體形成率和再生率。

2.2 溶菌酶濃度對原生質體形成率與再生率的影響

由圖2 可知，隨著酶質量濃度的增加，原生質體的形成率呈上升趨勢，而再生率逐漸下降。制備融合子，在保證一定形成率的前提下，更多地應考慮再生率。溶菌酶質量濃度為1.0～5.0 mg/mL（嗜酸乳桿菌）和2.0 mg/mL（地衣芽孢桿菌）時，可兼顧較高的原生質體形成率和再生率。

2.3 酶解時間對原生質體形成率與再生率的影響

在制備原生質體時，酶解時間是一個很重要的因素。酶解時間延長，溶菌酶進一步破壞原生質體膜，使其完整性受損，影響細胞壁的再生。另外，酶解時間過長也可使原生質體的生理狀態(tài)變差，無核原生質體的數(shù)量增加，再生能力減弱。由圖3 可知，當酶解時間為40 min 時，大多數(shù)嗜酸乳桿菌已形成原生質體，原生質體形成率達到91.76%，隨后開始下降，說明酶解時間的延長會引起原生質體的死亡，進而降低原生質體再生率。同理，地衣芽孢桿菌原生質體的形成率隨酶解時間的延長而逐漸增加并在后期趨于平緩，再生率則呈現(xiàn)下降趨勢，在酶解4 h 時，可兼顧較高的原生質體形成率（85.8%）和再生率（21.8%）。

2.4 酶解溫度對原生質體形成率與再生率的影響

溫度對酶解作用具有多重影響。溫度升高，酶解反應速度加快，同時引起酶的鈍化[14-15]；另外，溫度升高也加大了酶對原生質體的毒害作用，影響原生質體的再生率。由圖4 可知，酶解溫度對再生率影響較大。30～42 ℃范圍內(nèi)，嗜酸乳桿菌的再生率由5.35%降至0.32%；25～42 ℃范圍內(nèi)，地衣芽孢桿菌的再生率由14.1%降至0.6%?？紤]到脫壁與再生的共同效應，兼顧原生質體形成率和再生率，確定2 個親本菌株的酶解溫度為37 ℃。

2.5 原生質體制備工藝的優(yōu)化

表2 嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌原生質體制備的正交試驗結果L9（34）

由表2 可知，組合9（A3B3C2D1）的2 個親本菌株的原生質體形成率均最高，嗜酸乳桿菌對應的參數(shù)為：培養(yǎng)12 h 的菌體用5.0 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解30 min；地衣芽孢桿菌對應的參數(shù)為：培養(yǎng)8 h的菌體用2.5 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解3 h。影響2 個親本菌株原生質體制備的4 個因素從大到小排序為：A（菌齡）＞D（酶解時間）＞C（酶解溫度）＞B（酶濃度）。

以組合9 的條件分別制備嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的原生質體，以PEG6000 為融合劑制備融合子，結果如表3 所示，原生質體融合率分別為4.6×10-6和3.8×10-6。經(jīng)鑒定，再生培養(yǎng)基上形成的融合子均為雜合子，既可產(chǎn)酸，也可形成芽孢，具有不同于2 個親本菌株的典型菌落特征。

表3 原生質體制備、再生與融合結果

3 結論

在嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌原生質體制備過程中，菌齡和酶解時間對原生質體形成率影響最大，其次為酶解溫度和溶菌酶濃度。經(jīng)過單因素試驗和正交試驗得出，嗜酸乳桿菌原生質體制備的最優(yōu)工藝為取培養(yǎng)12 h 的對數(shù)生長中后期菌體用5.0 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解30 min；地衣芽孢桿菌則取培養(yǎng)8 h（對數(shù)生長中后期）的菌體用2.5 mg/mL溶菌酶37 ℃酶解3 h。在上述條件下分別制備原生質體，以PEG6000 為融合劑制備融合子，嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的原生質體融合率分別為4.6×10-6和3.8×10-6，為產(chǎn)芽孢乳酸菌的原生質體育種及后續(xù)優(yōu)良菌株的篩選奠定了基礎。