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        2種中藥復(fù)方聯(lián)合植物乳桿菌對抗生素相關(guān)性腹瀉的緩解作用

        2021-02-24 05:19:28閆子鵬李光輝孟錦鑫韓艷君孫子龍
        山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年2期
        關(guān)鍵詞:參苓益氣湯頭孢曲松

        郭 新,閆子鵬,李光輝,孟錦鑫,韓艷君,孫子龍

        (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西太谷 030801)

        抗生素已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人和動物各種疾病的預(yù)防和治療中,對畜牧業(yè)的發(fā)展也起到了一定的促進(jìn)作用。然而,濫用或過量使用抗生素將會導(dǎo)致抗生素耐藥性、細(xì)菌易感性和反復(fù)感染的風(fēng)險增加,威脅人體健康和生態(tài)環(huán)境安全[1]??股叵嚓P(guān)性腹瀉是大多數(shù)抗生素長期應(yīng)用的常見并發(fā)癥,特別是廣譜抗生素,如克林霉素、β-內(nèi)酰胺類和第三代頭孢菌素[2-3]。腹瀉經(jīng)常發(fā)生在豬、羊等養(yǎng)殖場,發(fā)病速度快、病程短,必須及時進(jìn)行診斷和治療,否則將會導(dǎo)致動物大量死亡,給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[4]。

        中藥因其具有安全、高效、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點,在動物疫病防控中發(fā)揮著越來越大的作用[5]。微生物發(fā)酵是中藥材的重要炮制手段之一,運用發(fā)酵的手段對中藥材進(jìn)行處理,借助微生物與酶的作用,在一定的環(huán)境下,通過發(fā)酵可以改變其原有的性能,增強或產(chǎn)生新的功效,擴大治療范圍[6-8]。同時,發(fā)酵中藥還可以節(jié)省藥材資源,保護環(huán)境,增加中藥制劑的安全性以及質(zhì)量控制[9]。

        近年來,有很多研究顯示乳酸菌(Lactobacillus)在畜牧生產(chǎn)中以及中藥發(fā)酵中起著重要的作用,對動物機體的保健以及疾病的治療都有很好的效果。如在青貯飼料的發(fā)酵過程中添加乳酸菌,不僅可以有效地抑制有害菌的繁殖,而且也改善了飼料的發(fā)酵品質(zhì)[10]。乳酸菌發(fā)酵黃芪多糖制劑應(yīng)用在肉雞養(yǎng)殖上,可以提高肉雞的生長性能、改善肉雞腸道的微生物體系[11]。

        本研究通過植物乳桿菌發(fā)酵補中益氣湯和參苓白術(shù)湯,對小鼠稀便率、腸道形態(tài)、腸屏障功能相關(guān)基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 的表達(dá)進(jìn)行檢測,旨在通過利用中藥、益生菌或發(fā)酵中藥減輕由抗生素引起的腹瀉的研究提供一定理論依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 試驗對象 無特定病原體(SPF)級體質(zhì)量大小一致、健康的雄性ICR 小鼠(3 周齡)189 只,購自山西醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心。

        1.1.2 藥物和試劑 補中益氣湯(BZYQ)是由炙黃芪、黨參、炒白術(shù)、炙甘草、當(dāng)歸、陳皮、升麻、柴胡8 味中藥組成;參苓白術(shù)湯(SLBZ)是由黨參、茯苓、炒白術(shù)、山藥、炙甘草、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁、砂仁、桔梗、陳皮11 味中藥組成,藥材購自北京同仁堂藥店;頭孢曲松鈉購自北京索萊寶生物科技有限公司,植物乳桿菌CICC 21809 購自中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司;Trizol、PrimeScriptTM試劑盒和SYBRRPremix Ex TaqTMII 試劑盒均購自大連Takara公司;蘇木精-伊紅染色試劑盒、無水乙醇、二甲苯、中性樹脂均自北京索萊寶生物科技有限公司。

        1.1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、生物組織包埋機(金華惠友儀器設(shè)備有限公司)、生物組織切片機(德國Leica 儀器設(shè)備有限公司)、生物組織攤烤片機(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)、生物顯微鏡(日本Olympus 公司)、高精度移液槍(德國Eppendorf 公司)、超凈工作臺(北京昌平長城空氣凈化工程公司)、ND-2000 核酸蛋白測定儀(美國NanoDrop 公司)、Mx3000P 實時熒光定量PCR 儀(美國Stratagene 公司)。

        1.1.4 中藥、菌液與發(fā)酵中藥 按照《中華人民共和國獸藥典》[12]中的比例稱取1.1.2 中藥材,加蒸餾水浸泡1 h,煎煮2 次,每次45 min,過濾去渣,合并濃縮藥液為1 g/mL;使用食品級碳酸鈉將pH 值調(diào)至6.5,即制得補中益氣湯和參苓白術(shù)湯。將植物乳桿菌菌株接種到已滅菌的乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基(MRS)中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h,制得益生菌液(LP),并將其以3%的接種量分別接種到補中益氣湯和參苓白術(shù)湯中,在37 ℃下發(fā)酵24 h,以達(dá)到107cfu/mL。即制得補中益氣湯發(fā)酵液(FBZYQ)和參苓白術(shù)湯發(fā)酵液(FSLBZ)。

        1.2 方法

        1.2.1 模型制備及給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,小鼠隨機分成7 組,每組8 只,重復(fù)3 次。在空白對照組(BC)中,每天分別在9:00 和13:00 給小鼠灌胃0.3 mL 生理鹽水2 次;在頭孢曲松鈉組(CS,4 g/(kg·d))中,分別在9:00 和13:00 灌胃給小鼠0.3 mL 頭孢曲松鈉溶液和0.3 mL 生理鹽水;對于頭孢曲松鈉+益生菌組(CS+LP)、頭孢曲松鈉+補中益氣湯組(CS+BZYQ)、頭孢曲松鈉+參苓白術(shù)湯組(CS+SLBZ)、頭孢曲松鈉+補中益氣湯發(fā)酵液組(CS+FBZYQ)和頭孢曲松鈉+參苓白術(shù)湯發(fā)酵液組(CS+FSLBZ),分別于9:00 和13:00 通過灌胃給予小鼠0.3 mL 頭孢曲松鈉溶液和相應(yīng)的0.3 mL 藥液。各組小鼠單獨分籠飼養(yǎng),連續(xù)處理治療7 d,試驗期間各組飼養(yǎng)管理條件完全一致。在第1、4、7 d,分別記錄小鼠精神狀態(tài)和排便情況,在第8 天,對小鼠實施安樂死,將腸組織儲存在-80 ℃條件下,后續(xù)進(jìn)行qRT-PCR。每組3 個樣品固定在4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行腸道組織病理學(xué)觀察。

        1.2.2 稀便率測定 在13:00 灌胃2 h 內(nèi),分別統(tǒng)計每只小鼠的稀便數(shù)和總便數(shù)。稀便率為2 h 內(nèi)每只小鼠所排稀便數(shù)與總便數(shù)的比值。

        1.2.3 石蠟切片的制作及蘇木精-伊紅(HE)染色

        將固定好的組織沿橫截面切成1 cm 左右的管狀,進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋,使用切片機切成5 μm 厚的切片,攤片,烤片,之后用于HE 染色。

        將制得的切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水后;蘇木精染色,分化液分化,自來水沖洗藍(lán)化;再進(jìn)行梯度酒精脫水;然后伊紅染色;高濃度酒精脫水,二甲苯透明,最后中性樹膠封片,制得HE 染色切片。晾干后在顯微鏡下觀察各組小鼠十二指腸、空腸和回腸組織情況,并拍照保存。

        1.2.4 十二指腸和結(jié)腸基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 相對表達(dá)量測定

        1.2.4.1 引物設(shè)計與合成 由Primer 3.0 plus 設(shè)計的內(nèi)參基因和目的基因的序列為GAPDH、AQP8和Claudin-1(表1),引物均由生工生物工程有限公司合成。

        表1 引物序列信息

        1.2.4.2 RNA 提取和qRT-PCR 將0.5~1.0 cm 的十二指腸和結(jié)腸組織剪碎,將其加到1 mL 的Trizol中進(jìn)行RNA 提取。RNA 的質(zhì)量用核酸蛋白濃度測定儀(ND-2000)鑒定;然后使用PrimeScriptTM試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,使用SYBRRPremix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 擴增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃30 s;PCR 反應(yīng)95 ℃5 s,60 ℃30 s,72 ℃30 s;溶解曲線分析95 ℃15 s,60 ℃1 min,95 ℃15 s,并重復(fù)40 個周期。

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。稀便率和基因相對表達(dá)水平采用方差分析(ANOVA),用Tukey's進(jìn)行檢驗(P<0.05 為差異顯著)。將GAPDH 作為內(nèi)參,通過2-ΔΔCt法得出目的基因AQP8 和Claudin-1 的相對表達(dá)水平。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 小鼠精神狀態(tài)觀察

        試驗前,小鼠活潑好動,糞便正常;造模后,小鼠表現(xiàn)腹瀉、稀便、精神萎靡,毛色光澤度較差;而治療后上述癥狀有所緩解。

        2.2 不同處理組小鼠稀便率的變化

        從圖1 可以看出,與對照組相比,在第1、4、7 天頭孢曲松鈉組的小鼠稀便率均顯著上升(P<0.05),表明模型成功建立。其中,第1 天,除益生菌組外,其他給藥組小鼠的稀便率與頭孢曲松鈉組相比均無顯著性差異(P>0.05);第4 天,除參苓白術(shù)湯組外,其他給藥小鼠的稀便率與頭孢曲松鈉組相比均顯著下降(P<0.05);第7 天,與頭孢曲松鈉組相比,發(fā)酵組小鼠稀便率顯著性下降(P<0.05),且補中益氣湯發(fā)酵液組和參苓白術(shù)湯發(fā)酵液組的稀便率從第4~7 天持續(xù)顯著下降(P<0.05)。

        2.3 不同處理組小鼠小腸的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

        各組小鼠小腸形態(tài)如圖2、3、4 所示,可以觀察到對照組小鼠的十二指腸、空腸和回腸3 種小腸絨毛結(jié)構(gòu)正常,絨毛與隱窩界限分明,基本完好,無明顯的病理變化(圖2-A、3-A、4-A);而頭孢曲松鈉處理引起小鼠的十二指腸、空腸和回腸的腸黏膜損傷,表現(xiàn)出短而寬的絨毛,深的隱窩,不完整和斷裂、脫落的結(jié)構(gòu)等病理變化(圖2-B、3-B、4-B);其他各個給藥組均有不同程度的緩解效果,排列較為整齊緊密,結(jié)構(gòu)相對完整。且發(fā)酵組的絨毛較長,緩解效果最好。

        2.4 不同處理組小鼠十二指腸和結(jié)腸的基因表達(dá)量分析

        各組小鼠的水通道蛋白AQP8 和緊密連接蛋白Claudin-1 在十二指腸和結(jié)腸中的mRNA 相對表達(dá)水平如圖5、6 所示,在十二指腸中,與對照組相比,頭孢曲松鈉組的AQP8 mRNA 的相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05);與頭孢曲松鈉組相比,除參苓白術(shù)湯組,其他給藥組的AQP8 mRNA 相對表達(dá)量均顯著上升(P<0.05);相比頭孢曲松鈉組,補中益氣湯發(fā)酵液組的Claudin-1 mRNA 的相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05),其他處理組之間無顯著性差異(P>0.05)。在結(jié)腸中,與對照組和益生菌組相比,頭孢曲松鈉組的AQP8 mRNA 的相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05),盡管其他給藥組都有上升趨勢,但差異均不顯著(P>0.05);同時Claudin-1 mRNA 的相對表達(dá)量各處理組間無顯著性差異(P>0.05)。

        3 結(jié)論與討論

        為了觀察中藥、益生菌和發(fā)酵中藥對抗生素相關(guān)性腹瀉的緩解作用,本研究通過灌胃頭孢曲松鈉成功建立了小鼠腹瀉模型,它是廣譜的第三代頭孢菌素,廣泛用于治療胃腸道感染,但是重復(fù)使用會破壞腸道菌群的平衡,并引起腹瀉等副作用[12]。

        越來越多的證據(jù)表明,益生菌可以有效地恢復(fù)和平衡腸道菌群,預(yù)防和治療抗生素引起的腹瀉[13]。郭元晟等[14]研究結(jié)果表明,乳酸桿菌可以促進(jìn)肉雞小腸絨毛的生長發(fā)育,改善小腸的黏膜結(jié)構(gòu)。還有一些研究發(fā)現(xiàn),脾胃虛弱類型的比例在抗生素相關(guān)性腹瀉患者中最大,因此,在臨床藥物和日常飲食中,補氣、益氣類中藥被用于治療腸道疾病、增強免疫力、緩解疲勞和延長壽命等[15]。補中益氣湯、參苓白術(shù)湯作為經(jīng)典的健脾益氣、澀腸止瀉方劑,經(jīng)常被用來治療脾胃虛弱、腹瀉等[16-17]。在本研究中,用中藥、益生菌和發(fā)酵中藥連續(xù)治療7 d 后,腹瀉小鼠稀便率顯著下降,其中,補中益氣湯發(fā)酵液和參苓白術(shù)湯發(fā)酵液有持續(xù)緩解腹瀉效果,表明發(fā)酵具有一定的優(yōu)勢。

        腸道是重要的內(nèi)臟器官之一,不僅可以消化和吸收營養(yǎng),還可以保護人體免受病原微生物的侵害。在本研究中,通過HE 染色觀察發(fā)現(xiàn),頭孢曲松鈉組小鼠小腸絨毛受損,短而寬,出現(xiàn)不完整和斷裂、脫落的結(jié)構(gòu),表明小腸的吸收功能和屏障功能受到嚴(yán)重?fù)p害[18]。小鼠腹瀉后,腸道中的水分增加,糞便軟化,在一定程度上刺激腸道黏膜,從而引起黏膜損傷。研究表明,中藥在治療腸黏膜屏障功能障礙中具有明顯的優(yōu)勢[19]。小鼠灌服中藥、益生菌和發(fā)酵中藥后,腸絨毛損傷較輕,說明它們能夠減輕腹瀉對腸黏膜的刺激,對腸絨毛的完整性起到一定的保護作用。

        腸上皮細(xì)胞通過緊密連接蛋白連接,從而調(diào)節(jié)腸道屏障通透性和上皮完整性。因此,緊密連接蛋白的穩(wěn)態(tài)表達(dá)對于維持人類和動物健康至關(guān)重要[20],其中,Claudin-1 是緊密連接結(jié)構(gòu)中最關(guān)鍵的組成部分之一[21]。水通道蛋白(AQP)主要在胃腸道中表達(dá),并且在一些生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[22],且遠(yuǎn)端小腸和近端結(jié)腸是AQP8 表達(dá)的主要部位[23]。張文娣等[24]觀察顯示,與抗生素相關(guān)的腹瀉大鼠表現(xiàn)出胃腸道完整性下降和上皮組織不良,與對照組相比,水通道蛋白編碼基因、緊密連接蛋白異常表達(dá)和杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。同樣地,本試驗研究發(fā)現(xiàn),腹瀉小鼠的十二指腸和結(jié)腸中的AQP8 mRNA 表達(dá)水平顯著降低。在給予益生菌、補中益氣湯和補中益氣湯發(fā)酵液和參苓白術(shù)湯發(fā)酵液的小鼠中,AQP8 mRNA 表達(dá)水平得到了增強,十二指腸效果更明顯。Claudin-1 mRNA 表達(dá)水平在補中益氣湯發(fā)酵液中顯著上升。這些結(jié)果大致與觀察到的腸道形態(tài)結(jié)果一致,表明中藥、益生菌和發(fā)酵中藥在分子水平上顯示出有益的特性。

        本研究結(jié)果表明,頭孢曲松鈉引起了腹瀉,導(dǎo)致了短而寬的絨毛以及腸結(jié)構(gòu)的不完整和破裂,并且與腸屏障功能相關(guān)基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 表達(dá)下降。但是,中藥、益生菌和發(fā)酵中藥均不同程度緩解了頭孢曲松鈉引起的變化,特別是發(fā)酵中藥顯示出更持久的緩解作用。研究結(jié)果為中藥、益生菌和發(fā)酵中藥在抗生素臨床使用上的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了試驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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