楊 楠， 劉 倩， 陳 蕾， 王婷婷

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院1.腎臟內科；2.內分泌內科，湖南 長沙 410007

糖尿病腎病(diabetes nephrosis，DN)是糖尿病患者常見并發(fā)癥，可引起腎的進行性損傷，并導致腎功能減退甚至衰竭，是糖尿病患者主要病死原因之一[1]。DN患者通過尿微量白蛋白/尿肌酐比值(albumin to creatinine ratio，ACR)監(jiān)測病情，但ACR主要反映腎小球損傷情況，部分糖尿病患者ACR無異常時，腎功能實質上已開始減退，ACR并不能全面及早期的評估DN引起的腎損傷[2]。因此，選擇更為敏感的指標來早期預測DN發(fā)生、監(jiān)測病情情況，對DN的診斷、治療及預后評估都極為重要。乙二醛酶Ⅰ(glyoxalase Ⅰ，GLOⅠ)是體內主要的α羰基醛解毒酶，可催化甲基乙二醛轉化為乳酸，從而減少糖基化終末產(chǎn)物生成[3]。有研究報道，血清GLOⅠ水平降低與糖尿病視網(wǎng)膜損傷、大血管損傷、周圍神經(jīng)病變等慢性并發(fā)癥均有一定關聯(lián)[4-5]。相對于血液標本，尿液標本具有易于采集、連續(xù)采集標本時患者更易接受、更適合動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)勢。本研究探討DN患者尿液GLOⅠ水平，分析其在診斷DN中的臨床價值。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1—12月收治的2型糖尿病患者74例，按照患者ACR劃分為非DN組(ACR<30 mg/g，n=34)、DN微量蛋白尿組(30 mg/g≤ACR<300 mg/g，n=18)、DN大量蛋白尿組(ACR≥300 mg/g，n=22)；同時，選取同期體檢的35例健康者為健康組。納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)糖尿病患者符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[6]，健康組無身體疾??；(3)患者臨床資料完整。排除標準：(1)患有癌癥者；(2)患有代謝性疾病者；(3)患有精神疾病者；(4)嚴重的心、肝和肺等器官功能異常者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 無菌試管收集清潔中段尿5 ml，3 000 r/min，離心10 min，取上清采用免疫比濁法檢測尿微量白蛋白，肌氨酸氧化酶法檢測尿肌酐,并計算ACR，檢測儀器為美國貝克曼AU5812全自動生化分析儀；取上清采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測尿液GLOⅠ水平，檢測儀器為美國百樂公司iMARK 680酶標儀。所有檢測均按照標準作業(yè)程序嚴格執(zhí)行，且均在質控通過后獲得。取1 ml的尿液標本，加入0.5 ml尿素、1 ml氫氧化銨、0.5 ml的0.02%十二烷基硫酸鈉。用Centrisart超速離心過濾裝置(20 kDa分子量；Sartorius，Goettingen，德國)，3 000 r/min離心10 min，以去除高分子量多肽。取濾液1 ml，用PD-10脫鹽柱(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)將濾液脫鹽。進行雙向凝膠電泳，選取差異蛋白，進行毛細管電泳結合質譜分析。檢測到的質譜分析信號都在Microsoft SQL數(shù)據(jù)庫中保存，匹配和注釋。

1.3 觀察指標 觀察GLOⅠ在各組尿液中的表達差異。記錄并比較各組尿液GLOⅠ、ACR，分析尿液GLOⅠ水平與ACR的相關性及GLOⅠ水平、ACR在診斷DN中的價值。

2 結果

2.1 尿液標本質譜分析 雙向凝膠電泳對蛋白斑點分析尋找差異蛋白，見圖1a。經(jīng)質譜分析和數(shù)據(jù)庫匹配發(fā)現(xiàn)，4組尿液標本中GLOⅠ水平呈現(xiàn)明顯差異，見圖1b。蛋白定量發(fā)現(xiàn)，隨著ACR的升高，GLOⅠ相對表達量遞減，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1c。

圖1 4組尿液標本中GLOⅠ表達情況(a.雙向凝膠電泳圖；b.雙向電泳顯示GLOⅠ表達情況；c.GLOⅠ相對表達量)

2.2 4組間ACR、尿液GLOⅠ比較 非DN組、DN微量蛋白尿組、DN大量蛋白尿組患者ACR高于健康組，尿液GLOⅠ低于健康組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DN微量蛋白尿組、DN大量蛋白尿組患者ACR高于非DN組，且DN大量蛋白尿組高于DN微量蛋白尿組；DN微量蛋白尿組、DN大量蛋白尿組患者尿液GLOⅠ低于非DN組，且DN大量蛋白尿組低于DN微量蛋白尿組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組間ACR、尿液GLOⅠ比較

2.3 2型糖尿病患者尿液GLOⅠ與ACR相關性 Pearson相關性分析結果顯示，尿液GLOⅠ水平與ACR呈顯著負相關(r=-0.870 6，P<0.01)，見圖2。

圖2 2型糖尿病患者尿液GLOⅠ與ACR相關性

2.4 尿液GLOⅠ、ACR診斷DN的ROC曲線 尿液GLOⅠ診斷DN的ROC曲線下面積為0.980(95%可信區(qū)間0.953～1.007)，ACR診斷DN的ROC曲線下面積為0.749(95%可信區(qū)間0.627～0.870)，兩者均可用于DN的診斷，GLOⅠ診斷價值更高。見表2、圖3。

圖3 尿液GLOⅠ、ACR診斷DN的ROC曲線

表2 尿液GLOⅠ、ACR診斷DN的ROC曲線參數(shù)

3 討論

目前，DN診斷的金標準是病理診斷，但因其有創(chuàng)性而應用受限。臨床上廣泛應用的DN診斷及分期指標是ACR，但我國目前沒有尿微量白蛋白檢測的統(tǒng)一指南，且部分糖尿病患者在出現(xiàn)微量白蛋白尿之前已有不同程度的腎功能損傷，導致ACR對DN診斷的敏感性和特異性并不理想[7-8]。尿液被認為是腎疾病中發(fā)現(xiàn)生物標志物最適合的生物體液之一[9-11]。尿液樣本的優(yōu)勢包括收集的簡單性和非侵入性。與其他生物體液相比，尿液中腎來源(約70%)和血漿來源(約30%)蛋白質保證了尿液蛋白質的復雜性和穩(wěn)定性[12-14]。在尿液中尋找新的蛋白標志物，對于DN的早期診斷和治療可能具有重要意義。

GLOⅠ作為甲基乙二醛的重要降解酶之一，可降低作為非酶糖化反應中間體甲基乙二醛的含量，從而減少非酶糖化蛋白如糖基化終末產(chǎn)物的生成，保護機體免受糖基化終末產(chǎn)物所致的慢性損傷。GLOⅠ在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中顯著降低，且與血清中糖基化終末產(chǎn)物呈負相關[4]；血清中GLOⅠ降低與糖尿病慢性神經(jīng)損傷相關[15]。本研究利用蛋白組學結合質譜技術篩選出尿液GLOⅠ在4組間呈差異表達，且與DN病情嚴重程度有關。本研究還通過臨床標本分析進一步驗證了蛋白質組和質譜結果，且非DN組、DN微量蛋白尿組、DN大量蛋白尿組患者尿液GLOⅠ均低于健康組，說明尿液GLOⅠ水平在腎出現(xiàn)損傷的早期即出現(xiàn)下降。Pearson相關性分析結果顯示，尿液GLOⅠ水平與ACR呈顯著負相關(r=-0.870 6，P<0.01)。尿液GLOⅠ診斷DN的ROC曲線下面積為0.980(95%可信區(qū)間0.953～1.007)，ACR診斷DN的ROC曲線下面積為0.749(95%可信區(qū)間0.627～0.870)，兩者均可用于DN的診斷，尿液GLOⅠ診斷價值更高。本研究樣本量相對較少，且未對DN患者的治療和預后進一步追蹤，缺乏動態(tài)分析結果。后續(xù)研究中，將進一步擴大樣本量，在DN治療前、后連續(xù)分析尿液GLOⅠ的變化，從而更深入的探討尿液GLOⅠ在DN診斷、治療、護理和預后監(jiān)控中的價值，同時，通過健康宣教提高患者對該疾病的早期認識和重視。

綜上所述，尿液GLOⅠ水平在糖尿病患者腎損傷早期即下降，且隨DN的進展其水平逐漸降低，可作為潛在的DN早期診斷標記物的候選。今后研究中，將深入分析尿液GLOⅠ在DN中的作用及機制，探索其作為DN治療靶點的可行性。