楊仁國賀微微羅婷婷

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院感染科,成都 610072)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一個包含非酒精性脂肪肝(NAFL),非酒精性脂肪肝炎(NASH)及肝硬化等病變的病理綜合征,是最常見的臨床肝病,病理學(xué)改變與酒精性肝病相似[1-3]。 其中肥胖,2 型糖尿病,高胰島素血癥和血脂異常等代謝綜合征被認為是NAFLD 發(fā)生的主要因素[4-5]。 嚙齒動物中的NAFLD 通常是由高脂飲食(HFD)引起的,會刺激肝臟中脂肪的過度積累并增強巨噬細胞的活化,從而加劇胰島素抵抗,肝炎癥和纖維化[6]。盡管基于NAFLD 發(fā)病機理的“兩次打擊”理論已被廣泛接受,但NAFLD 發(fā)展中涉及的機制仍在爭論中。

miRNA 是一類小非編碼RNA,長度為19～24 個核苷酸,主要通過與多種核苷酸的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平上負面調(diào)節(jié)基因表達,從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。 肝中miR-29b 的表達已為人所知,但其功能尚不清楚。 Sendi 等[7]報道m(xù)iR-29b 和CLDN 是慢性丙型肝炎中肝纖維化晚期和HCV-RNA的新預(yù)測因子。 Zhang 等[8]證明miR-29b 可以抑制肝星狀細胞中膠原的成熟,最近研究顯示血清miR-29b 與NAFLD 之間存在正相關(guān)[9]。 而IGF-1 是一種重要的合成代謝生長因子,在生長過程中參與組織發(fā)育,成熟組織和細胞的適應(yīng)和再生[10],血清IGF-1 水平低與NAFLD 的組織學(xué)嚴(yán)重程度升高相關(guān)[11]。 盡管研究表明miR-29b 可以通過靶向IGF-1 抑制結(jié)直腸癌細胞的生長并調(diào)節(jié)成骨細胞分化[12],但尚不清楚miR-29b 是否可以靶向IGF-1 來調(diào)節(jié)NAFLD 中的脂質(zhì)蓄積和肝纖維化。 因此,本研究旨在探討miR-29b 在NAFLD 中對IGF-1 的作用和潛在的調(diào)控機制,為臨床治療作基礎(chǔ)研究。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

L02 細胞系購于中國武漢普諾賽生命科技公司。

1.2 主要試劑與儀器

RIPA-1640 培養(yǎng)基(含雙抗)、胎牛血清、減血清培養(yǎng)基均購于Gibco 公司；牛血清白蛋白、購于Sigma 公司；油紅O 染色劑購于北京索萊寶公司；甘油三酯(TG)與總膽固醇(TC)試劑盒購于南京建成公司；miR-29b-3p 模擬物、抑制劑與陰性對照模擬物均購于廣州日博生物有限公司；IGF-1 siRNA 與陰性對照siRNA 由上?；蛑扑幙萍加邢薰竞铣桑籖NA 提取試劑盒購于賽默飛世爾公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；psiCHECK-2 熒光素酶載體、雙熒光素報告試劑盒購于普洛麥格(北京)公司；IGF-1、Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA 和β-actin 均購于abcam 公司；所有引物及序列由上海生工股份有限公司提供；RT-qPCR 系統(tǒng)；酶標(biāo)儀(Thermo 公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)；全功能成像儀(Bio-Rad 公司)；蛋白質(zhì)電泳儀(Bio-Rad 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 NAFLD 細胞模型的構(gòu)建

將L02 細胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基(含1%的青霉素與鏈霉素)中,在37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng),中途更換培養(yǎng)液進行傳代備用。 使用含有1%無脂肪酸的牛血清白蛋白的培養(yǎng)基制備0.3 mmol/L 棕櫚酸溶液,將培養(yǎng)至生長對數(shù)期后的L02 細胞重新培養(yǎng)至6 孔板,生長貼壁后用0.3 mmol/L PA 溶液在37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,供后續(xù)實驗使用。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染

將培養(yǎng)好的細胞進行分組：空白組、模型組(50 pmol/mL 陰性對照si-RNA)、陰性對照組(50 pmol/mL 陰性對照模擬物)、抑制組(50 pmol/mL miR-29b-3p 抑制劑)、過表達組(50 pmol/mL miR-29b-3p模擬物)和IGF-1 沉默組(50 pmol/mL miR-29b-3p模擬物+40 pmol/mL IGF-1 siRNA),除空白組外,各組按說明書進行轉(zhuǎn)染24～48 h 后進行后續(xù)實驗。

1.3.3 載體構(gòu)建及雙熒光素酶檢測實驗

使用Targetscan Human 7.2 數(shù)據(jù)庫(http：/ /www.targetscan.org)進行生物信息學(xué)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)IGF-1 是miR-29b-3p 的直接靶點,然后使用雙熒光素酶報告進行驗證：通過PCR 擴增包含miR-29b-3p 結(jié)合位點的野生型(WT)或突變型(Mut)片段的IGF-1 3'非翻譯區(qū),然后將其克隆到psiCHECK-2 熒光素酶載體中以形成報告子載體,分別命名為IGF-1 wt 和IGF-1 Mut。 將L02 細胞接種到24 孔板(5×104細胞/孔-1)培養(yǎng)24 h 后,用2 μg/mL 的IGF1 3′UTR 載體(WT 和Mut)、100 ng/mL 的pRLTK 熒光素酶質(zhì)粒以及50 pmol/mL 的miR-29b-3p模擬物、抑制劑和NC 模擬物、抑制劑共同轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h,使用雙熒光素報告試劑盒測量螢光素酶活性。

1.3.4 脂質(zhì)沉積指標(biāo)測定

各組細胞用PBS 清洗后加入無水乙醇500 μL,細胞刮收集細胞后3000 r/min 離心收集上清液,按試劑盒說明書測定TG 與TC 的含量。

1.3.5 油紅O 染色

各組細胞培養(yǎng)24 h 后用4%多聚甲醇固定1 h,0.2%的油紅O 異丙醇染液染色20 min,清洗后烘干,在倒置顯微鏡下觀察,拍照。

1.3.6 RT-qPCR

各組按照RNA 提取與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作,使用RT-qPCR 法檢測miR-29b-3p 基因的表達,使用軟件分析檢測樣本的CT 值,采用2-△△CT值反映相對表達水平。

1.3.7 Western blot

使用Western blot 法測定細胞中檢測IGF-1、纖維化標(biāo)志蛋白α-SMA、Collagen I 和Collagen Ⅲ的蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 使用SPSS 25.0 用于數(shù)據(jù)分析,進行方差齊性檢測,統(tǒng)計方法為單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSDt檢驗。P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA 對L02 細胞中miR-29b-3p 與IGF-1 的影響

檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組的TG 和TC含量顯著增加(P＜0.05)(表1)；同時,油紅O 染色顯示L02 細胞在PA 未做處理的L02 細胞中未出現(xiàn)脂質(zhì)滴(圖1A),處理后顯示出明顯的脂質(zhì)滴(圖1B),綜合兩項結(jié)果說明NAFLD 細胞模型構(gòu)建成功。 RT-qPCR 與Western blot 檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,PA 處理后,L02 細胞中miR-29b-3p顯著增加,而IGF-1 表達降低(P＜0.05)(表1 和圖1C)。

表1 PA 對L02 細胞中miR-29b-3p 與IGF-1 的影響(n＝3)Table 1 Effect of PA on miR-29b-3p and IGF-1 in L02 cells

圖1 NAFLD 細胞模型中油紅染色與WB 結(jié)果圖Note.A/B, Oil red staining diagrams.C, Western blot.Figure 1 Oil red staining and Western blot results in NAFLD cell model

2.2 IGF-1 是miR-29b-3p 的直接作用靶點

雙重?zé)晒馑孛笀蟾婊驒z測發(fā)現(xiàn),miR-29b-3p的過表達明顯降低了野生型IGF-1 3′-UTR 螢光素酶的活性(P＜0.05),而miR-29b-3p 的抑制作用顯著提高了野生型IGF-1 3′-UTR 的螢光素酶的活性(P＜0.05),而突變型IGF-1 3′-UTR 螢光素酶的活性在用miR-29b-3p 模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染后沒有明顯變化(P＞0.05)；同時,在用miR-29b-3p 激動劑轉(zhuǎn)染后,IGF-1 蛋白和mRNA 的表達顯著性降低,而miR-29b-3p 抑制劑轉(zhuǎn)染后IGF-1 蛋白和mRNA 的表達顯著性升高(P＜0.05),見圖2、表2。

2.3 抑制miR-29b-3p 對NAFLD 細胞模型的影響

進一步設(shè)計功能喪失實驗以驗證miR-29b-3p在脂質(zhì)代謝和肝細胞纖維化中的作用。 與模型組相比,抑制miR-29b-3p 后,經(jīng)PA 誘導(dǎo)處理的L02 細胞中TG 和TC 含量顯著降低(P＜0.05)；油紅O 染色結(jié)果表明,抑制miR-29b-3p 后再經(jīng)過PA 處理可以減少L02 細胞中脂質(zhì)滴的數(shù)量。 此外,我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-29b-3p 可以顯著性降低PA 處理后L02 細胞中IGF-1 與纖維化標(biāo)記物(包括α-SMA,I 型膠原和III 型膠原)的蛋白質(zhì)表達水平(P＜0.05),見表3、圖3。

圖2 雙重?zé)晒馑孛笀蟾媾cIGF-1 蛋白和mRNA 的表達結(jié)果圖Note.A, Predicted miR-29b-3p binding site on IGF-1.B, IGF-1 of each group Western blot.Figure 2 Dual luciferase report and IGF-1 protein and mRNA expression results

表2 雙重?zé)晒馑孛笀蟾媾cIGF-1 蛋白和mRNA 的表達結(jié)果(n＝3)Table 2 Dual luciferase report and IGF-1 protein and mRNA expression results

表3 抑制miR-29b-3p 對NAFLD 細胞模型的影響結(jié)果(n＝3)Table 3 Effect of miR-29b-3p inhibition on NAFLD cell model

圖3 抑制miR-29b-3p 對NAFLD 細胞模型的影響Note.A, Oil red staining result.B, Western blot.Figure 3 Effect of miR-29b-3p inhibition on the NAFLD cell model

2.4 過表達miR-29b-3p 與沉默IGF-1 對NAFLD細胞模型的影響

功能修復(fù)實驗顯示,與模型組相比,過表達組與沉默組的TG 和TC 含量顯著性增加以及脂質(zhì)積累增加(P＜0.05)。 Western 印跡結(jié)果顯示,沉默組中纖維化標(biāo)記物(包括α-SMA,I 型膠原和III 型膠原)的蛋白表達水平增加,IGF-1 蛋白的表達降低(P＜0.05),見表4、圖4,說明沉默IGF-1 的表達可增加miR-29b-3p 的效果,促進NAFLD 的形成。

3 討論

NAFLD 是一種慢性進行性肝病,屬于單純性肝脂肪變性,是一種可能發(fā)展為嚴(yán)重肝硬化的疾病[13]。 因此,了解NAFLD 的發(fā)病機理并開發(fā)有效的治療方法就變得越來越重要。 miRNA 在各種生理和病理學(xué)過程中起重要作用,包括細胞增殖、分化、代謝和先天免疫[14]。 目前研究已從高脂飲食或遺傳因素誘導(dǎo)的肥胖鼠類和重度NAFLD 患者的肝中發(fā)現(xiàn)了miRNA 失調(diào),這提示miRNA 在飲食調(diào)節(jié)引起的肝功能障礙發(fā)展中的潛在作用[15]。 最近的研究表明,各種miRNA 被確定為脂類代謝、胰腺細胞發(fā)育、脂肪因子表達和脂肪形成中的重要調(diào)控因子[16]。 此外,miRNA 被認為是包括NAFLD 在內(nèi)的人類肝疾病的潛在治療靶標(biāo)和生物標(biāo)記物[17]。 因此在本研究中,我們著眼于miR-29b-3p 的異常表達,并通過靶向IGF-1 研究了miR-29b-3p 對NAFLD體外脂質(zhì)代謝和纖維化的調(diào)節(jié)。

越來越多的研究強調(diào)了miRNA 在肝功能和疾病中基因調(diào)控的作用。 許多關(guān)于NAFLD 的肝臟病理學(xué),包括肝炎癥反應(yīng)、結(jié)構(gòu)損傷和脂質(zhì)沉積,均由一種或多種miRNA 調(diào)節(jié)[18]。 例如,miR-192-5p 可以通過直接NAFLD 中SCD-1 的蛋白表達來抑制脂質(zhì)合成[19]。 He 等[20]報告說,miR-26a 通過NAFLD中miR-26a/IL-6/I/L7 信號通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。miR-29 家族包括三個同源基因,即miR-29a、miR-29b 和miR-29c,它們由兩個基因簇編碼[21]。 Peng等[22]報道,miR-29 在SCAP/SREBP-1 信號傳導(dǎo)中介導(dǎo)新的負反饋回路,以控制脂質(zhì)代謝。 最近的研究表明,miR-29b 與NAFLD 呈正相關(guān)關(guān)系[9]。 但是,沒有證據(jù)顯示miR-29b-3p 在調(diào)控NAFLD 細胞模型的脂質(zhì)蓄積和纖維化作用。 PA 是高脂食物中最常見的游離脂肪酸之一,也是體循環(huán)中第二豐富的游離脂肪酸[23]。 在本研究中,模型組細胞TG 和TC 的含量顯著增加與油紅O 染色中出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)滴證明我們通過PA 成功構(gòu)建了NAFLD 體外細胞模型。 同時,miR-29b-3p 在NAFLD 體外細胞模型中高度表達,而IGF-1 表達顯著降低(P＜0.05),這些數(shù)據(jù)表明miR-29b-3p 和IGF-1 在NAFLD 過程中起關(guān)鍵作用。

眾所周知,miRNA 通過直接調(diào)控靶基因來產(chǎn)生細胞生物學(xué)行為。 目前已經(jīng)鑒定出許多miR-29b-3p 的靶基因,其中就包括IGF-1[12]。 在本研究中,為了進一步研究miR-29b-3p 調(diào)控NAFLD 細胞模型中脂質(zhì)蓄積和纖維化的分子機制,使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-29b-3p 的潛在靶標(biāo)。 其結(jié)果揭示了IGF-1 是L02 細胞中miR-29b-3p 的直接靶標(biāo),雙重?zé)晒馑孛笀蟾婊驒z測、RT-qPCR 和Western blot的結(jié)果也證明miR-29b-3p 靶向IGF-1 并在體外抑制IGF-1 表達。

表4 過表達miR-29b-3p 與沉默IGF-1 對NAFLD 細胞模型的影響(n＝3)Table 4 Effects of overexpression of miR-29b-3p and silent IGF-1 on NAFLD cell model

圖4 過表達miR-29b-3p 與沉默IGF-1 對NAFLD 細胞模型的影響Note.A, Result of oil red staining.B, Western blot.Figure 4 The effect of overexpression of miR-29b-3p and silenced IGF-1 on NAFLD cell model

為了更深入地探討miR-29b-3p 與IGF-1 的調(diào)節(jié)關(guān)系,我們設(shè)計了功能喪失實驗,進一步探討了miR-29b-3p 對NAFLD 細胞模型中IGF-1 表達的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果表明,抑制miR-29b-3p 表達可減少NAFLD 體外細胞模型中TG 和TC 的生成,并減少脂滴的數(shù)量和纖維化標(biāo)記物的蛋白表達水平,表明miR-29b-3p 可能在NAFLD 脂質(zhì)積累和肝細胞纖維化中起著負調(diào)節(jié)劑的作用。 同時PA 處理后,IGF-1的表達顯著下降,并且被miR-29b-3p 抑制,提示抑制miR-29b-3p 可以減少NAFLD 細胞模型的脂質(zhì)蓄積和肝細胞纖維化,其機制與miR-29b-3p 調(diào)節(jié)IGF-1 蛋白表達有關(guān)。

為了確定IGF-1 是否參與miR-29b-3p 調(diào)節(jié)的肝細胞脂質(zhì)積累和纖維化,我們設(shè)計功能修復(fù)實驗。 如預(yù)期的那樣,在IGF-1 被siRNA 沉默后,miR-29b-3p 模擬物在NAFLD 細胞模型中誘導(dǎo)TG 和TC生成以及脂質(zhì)積累增加,同時過表達的miR-29b-3p誘導(dǎo)L02 細胞大量聚集包括α-SMA、I 型膠原和III型膠原等纖維化標(biāo)記物,并進一步降低IGF-1 蛋白的表達水平。 綜上所述,沉默IGF-1 增強了miR-29b-3p 對脂質(zhì)積累和纖維化標(biāo)記蛋白表達水平的促進作用,說明miR-29b-3p 通過直接靶向IGF-1 改進了肝細胞的脂質(zhì)蓄積和纖維化,發(fā)揮促NAFLD 的功能。

總而言之,本研究證明了在NAFLD 體外模型中miR-29b-3p 表達升高,而IGF-1 表達則在下降。 我們的研究進一步證明,抑制miR-29b-3p 可靶向抑制NAFLD 中的IGF-1 減少肝細胞脂質(zhì)蓄積和纖維化。我們的數(shù)據(jù)豐富了miRNA 在NAFLD 發(fā)育中的生物學(xué)功能。 同時,我們的研究表明抑制miR-29b-3p 可能是NAFLD 治療的有前途的策略。