孫曉峰劉 濤曾貴榮陳勇超伍參榮喬 江

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè),長沙 410208； 3.湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心＆新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙 410331；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,長沙 410208； 5.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,長沙 410007)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指各種因素導(dǎo)致的女性卵巢儲(chǔ)備功能下降,由此引發(fā)提前絕經(jīng)(40 歲之前)以及低雌激素、高促性腺激素癥狀。 近年來醫(yī)源性因素逐漸發(fā)展為POF 的重要因素[1-2],化療為其中之一,常見藥物有環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)、順鉑等。 化療所造成的POF 給女性患者帶來嚴(yán)重的生理問題和心理困擾[3]。 因此,如何恢復(fù)化療后女性卵巢功能,從而提高患者生存質(zhì)量顯得尤為重要。 顆粒細(xì)胞圍繞在卵母細(xì)胞周圍,不僅為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)支持,而且對(duì)卵泡的發(fā)育和成熟起重要作用[4-5]。 大量研究證實(shí)：CTX 在體內(nèi)被激活成具有活性的細(xì)胞毒性代謝物丙烯醛和PM,通過形成共價(jià)DNA 加合物造成DNA 結(jié)構(gòu)破壞,從而阻斷DNA 復(fù)制,抑制細(xì)胞的增殖,甚至誘導(dǎo)其凋亡。 左歸丸是中醫(yī)婦科臨床治療POF 的常用方藥,臨床多以其為基本方加減。 本課題組前期藥效學(xué)研究的卵巢組織免疫組化檢測結(jié)果顯示：在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,左歸丸降低了化療源性POF 小鼠顆粒細(xì)胞凋亡[6]。 自噬與凋亡能通過多種通路相互協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化,共同促進(jìn)細(xì)胞死亡,而目前關(guān)于CTX 損傷顆粒細(xì)胞以及左歸丸保護(hù)顆粒細(xì)胞的機(jī)制中是否存在自噬過程的研究甚少。 本實(shí)驗(yàn)以PM(CTX 的體外活性成分)建立化療源性體外顆粒細(xì)胞損傷模型,通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot 檢測各實(shí)驗(yàn)組顆粒細(xì)胞凋亡率及自噬與凋亡相關(guān)蛋白如卵巢自噬啟動(dòng)因子Beclin-1、微管結(jié)合蛋白輕鏈3(LC3BI/LC3BII)、自噬受體蛋白P62、凋亡蛋白Bax、Caspase3 的表達(dá),進(jìn)一步探討CTX 的活性成分——PM 建立體外誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞損傷模型以及左歸丸含藥血清對(duì)顆粒細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制,為進(jìn)一步揭示此過程中是否存在自噬與凋亡的交叉對(duì)話關(guān)系奠定基礎(chǔ),以期為臨床靶向治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD 大鼠60 只,SPF 級(jí),體重250 ～270 g,8周齡,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],在湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心＆ 新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[SYXK(湘)2015-0016]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019024),過程中遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的3R原則。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞,批號(hào)：iCell201910027,賽百慷上海生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑與儀器

左歸丸方劑由熟地、山藥、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟絲子、鹿角膠、龜板膠組成,購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬一醫(yī)院,按照8 ∶4 ∶4 ∶3 ∶4 ∶4 ∶4 ∶4比例制成生藥1 g/mL 的中藥浸膏備用；PM(江蘇倍達(dá)醫(yī)藥科技有限公司合成,批號(hào)20180908)；電泳儀,北京六一公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光儀,博路騰公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀,CytoFlex 公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡,OLYMPUS IX71 產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,批號(hào)：640914,Biolegend 產(chǎn)品；BCA 蛋白定量試劑盒,批號(hào)：P0012S,碧云天產(chǎn)品；RIPA 蛋白裂解液,批號(hào)：P0013B,碧云天產(chǎn)品；二抗：Anti Rabbit IgG/HRP,批號(hào)：AS014Abclonal 公司產(chǎn)品。 一抗：兔抗P62,批號(hào)：A19700、兔抗BECLIN,批號(hào)：A7353、兔抗 CASP3, 批 號(hào)： A19654、 兔 抗 BAX, 批 號(hào)：A19684、兔抗LC3B,批號(hào)：A19665,均為Abclonal 公司產(chǎn)品；β-actin 內(nèi)參,批號(hào)：AC026, Abclonal 公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模與分組

將原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞接種于96 孔板中,待細(xì)胞生長至底壁的75%～80%時(shí),將細(xì)胞分為4 組：①對(duì)照組(Control)；②模型組(M)；③左歸丸含藥血清組(10%ZGW)；④模型+左歸丸含藥血清組(M+10%ZGW)。 除對(duì)照組及左歸丸含藥血清組外,其余2 組每孔加入200 μL 終濃度為30 μmol/L 的PM進(jìn)行處理,37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h。

1.3.2 左歸丸含藥血清制備與給藥

SD 大鼠60 只隨機(jī)分為2 組：即正常血清組和ZG 血清組各30 只。 1 g/mL 的ZG 浸膏,根據(jù)成人與大鼠體表面積,換算成大鼠的用量,相當(dāng)于臨床等效劑量的9 倍,即按照245.7 g/(kg?d),每天分兩次給ZG 血清組大鼠灌服,連續(xù)3 d,正常血清組給予等量純凈水,于末次灌胃后2 ～2.5 h 麻醉后腹主動(dòng)脈采血,靜置30 min,離心后,無菌分離血清,-20℃保存,實(shí)驗(yàn)前56℃30 min 滅活,0.22 μm 濾器過濾后使用。 PM 處理相應(yīng)組24 h 后,Control 組及M 組加入10%正常大鼠血清；10%ZGW 組及M+10%ZGW 組加入10%左歸丸含藥血清,37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡情況

各組細(xì)胞離心收集,用4℃預(yù)冷PBS 洗滌2 次,然后用500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為106/mL,取100 μL 細(xì)胞懸浮于5 mL 流式管中,加入5 μL Annexin V-APC 混勻后,再 加入5 μL Propidium Iodide 混勻,于室溫避光孵育15 min,隨后重懸于400 μL PBS,400 目篩網(wǎng)過濾,加樣于流式細(xì)胞儀(FACS)檢測細(xì)胞凋亡。 獲得細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)后用ModFitLT 軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡相對(duì)定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,結(jié)果取3 次平均值。

1.3.4 Western blot 檢測各組目標(biāo)蛋白的表達(dá)

用胰酶消化好各組細(xì)胞后加入新鮮培養(yǎng)基,反復(fù)吹打使其脫壁并分散,制成細(xì)胞懸液,取各組適量細(xì)胞懸液置于已編號(hào)的EP 管內(nèi)經(jīng)1000 r/min 的速度離心5 min 后,棄去上清液,加入適量生理鹽水再次離心,棄去生理鹽水。 在EP 管內(nèi)加入一定量RIPA 蛋白裂解液提取蛋白后,以14000 r/min 的速度離心10 min,取上清液。 按照相應(yīng)的稀釋倍數(shù)將上樣緩沖液加入上清液中,在105℃環(huán)境中變性蛋白10 min,備用。 變性后的各組蛋白經(jīng)SDS 凝膠電泳(1～2 h)、轉(zhuǎn)膜(60～80 min)、封閉(30 ～60 min)、孵一抗(4℃過夜)、洗膜(10 min×3 次)、孵二抗(60 min)、再次洗膜(10 min×3 次)等步驟后,使用ECL顯影液進(jìn)行顯影,處理圖像,定性和定量分析各組條帶Beclin-1、LC3B、Bax 及P62 的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,結(jié)果取3 次平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 左歸丸含藥血清對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果見表1、圖1。 可知：模型組較對(duì)照組顆粒細(xì)胞早期和晚期凋亡率上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 而10%左歸丸含藥血清不僅能降低正常顆粒細(xì)胞的凋亡率,還可以降低PM誘發(fā)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡,且早期凋亡率有近4 倍差異,晚期凋亡率也有超過2 倍的差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 左歸丸含藥血清對(duì)Bax、LC3B、Beclin-1、P62及Caspase3 蛋白表達(dá)的影響

如圖2、表2 所示,模型組較對(duì)照組Bax、LC3B、Beclin-1 及Caspase3 蛋白表達(dá)上升,P62 蛋白表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而10%左歸丸含藥血清可降低正常和受損顆粒細(xì)胞Bax、LC3B、Beclin-1及Caspase3 蛋白表達(dá),升高正常和受損顆粒細(xì)胞P62 蛋白表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 左歸丸含藥血清對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響(,n＝3)Table 1 Effect of serum containing Zuogui Pill on apoptosis of granule cells

表1 左歸丸含藥血清對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響(,n＝3)Table 1 Effect of serum containing Zuogui Pill on apoptosis of granule cells

注：與對(duì)照組比較,*P ＜0.05；與模型組比較,#P ＜0.05。Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the model group, #P＜0.05.

分組Groups對(duì)照組Control左歸丸含藥血清組10%ZGW模型組M模型組+左歸丸含藥血清組M+10%ZGW早期凋亡率(%)Early apoptosis rate 3.21±0.29 1.43±0.07* 9.12±0.84* 2.41±0.13#晚期凋亡率(%)Late apoptosis rate 31.86±2.17 9.51±0.49* 48.92±0.65* 22.44±0.50#總凋亡率(%)Total apoptosis rate 35.07±2.19 10.95±0.56* 58.04±0.90* 24.85±0.47#

圖1 各組細(xì)胞周期分布Figure 1 cell cycle distribution of each group

圖2 左歸丸含藥血清對(duì)Bax、LC3B、Beclin-1、P62 及Caspase3 蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of serum containing Zuogui Pill on protein expression of Bax, LC3B, Beclin-1, P62 and Caspase3

表2 各組目標(biāo)蛋白灰度分析數(shù)值統(tǒng)計(jì)( ,n＝3)Table 2 Gray level analysis value statistics of target protein in each group

表2 各組目標(biāo)蛋白灰度分析數(shù)值統(tǒng)計(jì)( ,n＝3)Table 2 Gray level analysis value statistics of target protein in each group

注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,# P ＜0.05。Note.Compared with the control group, *P ＜0.05.Compared with the model group, #P＜0.05.

分組Groups對(duì)照組Control左歸丸含藥血清組10%ZGW模型組M模型組+左歸丸含藥血清組M+10%ZGW P62/β-actin 1.13 ± 0.22 1.70 ± 0.29* 0.69 ± 0.05* 0.92 ± 0.06#BECLIN-1/β-actin 0.94 ± 0.11 0.60 ± 0.12* 1.83 ± 0.18* 1.30 ± 0.16#CASP3/β-actin 0.91 ± 0.07 0.46 ± 0.16* 1.98 ± 0.29* 1.09 ± 0.06#BAX/β-actin 1.06 ± 0.29 0.71 ± 0.14* 2.55 ± 0.72* 1.34 ± 0.53#LC3B/β-actin 0.97 ± 0.06 0.65 ± 0.08* 1.95 ± 0.24* 1.40 ± 0.21#

3 討論

隨著腫瘤發(fā)病的年輕化以及自身免疫性疾病發(fā)病率的升高,化療藥物的使用也隨之上升,由此對(duì)女性患者所帶來的POF 問題引起許多學(xué)者的關(guān)注。 化療藥物對(duì)卵巢的影響主要與其對(duì)顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的損害有關(guān),且呈劑量依賴性[7]。 CTX是基礎(chǔ)的化療藥物,其可影響卵巢血供[8]、誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡[9]以及形成卵巢氧化應(yīng)激損傷[10],大多數(shù)研究集中在CTX 誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡這一機(jī)制上。

細(xì)胞自噬和凋亡被認(rèn)為是代表細(xì)胞死亡機(jī)制的連續(xù)部分：自噬為凋亡所必需,自噬先于凋亡,進(jìn)而促進(jìn)凋亡；或自噬抑制凋亡；或者自噬與凋亡共同促進(jìn)細(xì)胞死亡,抑制其中之一都會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N細(xì)胞死亡途徑。 自噬作為真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的降解和再循環(huán)系統(tǒng),在廢物清除、結(jié)構(gòu)重建、細(xì)胞生長發(fā)育、蛋白代謝平衡維持和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用[11]。 Beclin-1 是自噬啟動(dòng)關(guān)鍵因子；LC3B是自噬體的標(biāo)記蛋白,新合成的LC3B 蛋白經(jīng)加工后成為LC3B-I,位于細(xì)胞質(zhì)中,隨后LC3B-I 與磷脂酰乙醇胺連接,通過泛素化樣酶促反應(yīng)成為LC3BII,與自噬體的內(nèi)膜和外膜均結(jié)合,自噬體內(nèi)膜的LC3B-II 在自噬溶酶體中被降解而進(jìn)入再循環(huán),LC3B 的合成、LC3B-I 到LC3B-II 的轉(zhuǎn)化率是檢測自噬的通用指標(biāo)；自噬底物的降解通過標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)部受體蛋白P62 的降解來佐證自噬的完成,P62 蛋白水平高低與自噬活性成反比,其增加提示自噬/溶酶體降解途徑被抑制,其表達(dá)量變化可用于監(jiān)測自噬流[12]。 研究發(fā)現(xiàn)自噬與凋亡存在著分子聯(lián)系,在死亡受體和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中,自噬的調(diào)控蛋白Beclin1 是Caspase-3、-7、-8 的剪切對(duì)象[13],而Bax 屬于Bcl-2 家族成員之一,可作為Caspase-3 的上游調(diào)控蛋白,啟動(dòng)Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)[14]。 目前尚未有研究揭示PM 損傷顆粒細(xì)胞的機(jī)制中是否同時(shí)存在自噬與凋亡現(xiàn)象? 二者是否存在交叉對(duì)話?

中醫(yī)臨床上治療POF 時(shí)針對(duì)不同病因并無特定的治療方法,而是從辯證論治出發(fā),以補(bǔ)腎填精為主、活血理氣為輔,左歸丸是補(bǔ)腎填精的主要方劑。 課題組前期研究及其他相關(guān)研究證實(shí)：以CTX為代表的一些化療藥物可通過上調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)、下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)、促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡從而造成卵巢損傷。 而左歸丸可降低化療源性POF 小鼠顆粒細(xì)胞凋亡率,保護(hù)卵巢功能[6,15-16]。本實(shí)驗(yàn)建立PM 體外誘導(dǎo)原代卵巢顆粒細(xì)胞損傷模型,使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率并通過蛋白表達(dá)角度觀察顆粒細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白如Beclin-1、 LC3BI/LC3BII 及 凋 亡 相 關(guān) 蛋 白 Bax、Caspase3 的表達(dá)情況。 結(jié)果顯示：①模型組顆粒細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組而言顯著升高,10%左歸丸含藥血清可降低顆粒細(xì)胞凋亡率；②自噬相關(guān)蛋白如Beclin-1、 LC3BI/LC3BII 及 凋 亡 相 關(guān) 蛋 白 Bax、Caspase3 在PM 作用的顆粒細(xì)胞中,相對(duì)于對(duì)照組而言有高表達(dá),10%左歸丸含藥血清可下調(diào)上述蛋白在模型組中的表達(dá)；然而受體蛋白P62 的表達(dá)較對(duì)照組降低,10%左歸丸含藥血清可上調(diào)模型組P62 蛋白的表達(dá)。 以上結(jié)果說明PM 可通過促進(jìn)凋亡、激活自噬/溶酶體降解途徑的機(jī)制損傷顆粒細(xì)胞；10%左歸丸含藥血清能緩解由此帶來的損傷,同時(shí)影響了顆粒細(xì)胞自噬和凋亡過程,二者同時(shí)存在,且可能存在交叉對(duì)話。

綜上所述,PM 促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡過程,與自噬相關(guān),二者可能存在交叉對(duì)話。 左歸丸含藥血清抑制了化療損傷源性卵巢顆粒細(xì)胞凋亡,降低此過程中自噬與凋亡的活性,為下一步深入探討自噬與凋亡間交叉對(duì)話點(diǎn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),同時(shí)為左歸丸的藥效學(xué)研究提供了新的理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為POF 的防治提供新理論。 如能選擇性地抑制卵巢細(xì)胞的自噬與凋亡過程,保護(hù)卵巢逃避化療藥物的作用或化療后幫助恢復(fù)卵巢功能,則能極大地造福于化療后POF 患者,對(duì)于臨床具有重要意義。