孫冬梅，羅思妮，魏梅，朱德全，何廣銘，羅文安，楊銳培

(1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405)

大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim. ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖[1]。現(xiàn)代研究表明，大黃中主要的化學(xué)成分為蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、鞣質(zhì)類等化合物，具有抗腫瘤、抗炎、保肝等[2]豐富的藥理作用。大黃藥用歷史悠久，常作為君、臣藥在經(jīng)典中藥復(fù)方中發(fā)揮重要功效。但大黃為多基原的中藥，研究表明不同基原大黃所含化學(xué)成分種類和含量存在差異，導(dǎo)致其藥效和藥理作用也存在一定的區(qū)別[3-4]。近年來有學(xué)者對不同基原大黃的指紋圖譜及含量測定進(jìn)行了研究，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對不同品種大黃藥材的質(zhì)量進(jìn)行評價[5-7]，但目前尚未見指紋圖譜、多成分定量與多元統(tǒng)計分析相結(jié)合用于不同基原大黃質(zhì)量評價的研究。

本研究收集了來自不同道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)的51批大黃藥材，建立了指紋圖譜和同時測定14個化學(xué)成分含量的分析方法，并通過聚類分析、主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)不同基原大黃之間的差異性，為不同基原大黃的鑒別和質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1290型超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XP26型百萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；ME204E型萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(德國Merck公司)。

1.2 藥材

51批大黃藥材經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)孫冬梅教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖，藥材產(chǎn)地及詳細(xì)信息見表1。

表1 大黃藥材信息

1.3 試藥

對照品沒食子酸(含量90.8%，批號：110831-201605)，兒茶素(含量99.2%，批號：110877-201604)，番瀉苷A(含量94.7%，批號：110824-201301)，番瀉苷B(含量95.6%，批號：110825-201502)，蘆薈大黃素(含量98.3%，批號：110795-201710)，大黃酸(含量99.3%，批號：110757-201607)，大黃素(含量98.7%，批號：110756-201512)，大黃酚(含量99.2%，批號：110796-201319)及大黃素甲醚(含量99%，批號：110758-201616)購自中國食品藥品檢定研究院；對照品大黃酚-1-O-葡萄糖苷(含量99.9%，批號：6700)購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；對照品大黃酚-8-O-葡萄糖苷(含量98%，批號：CFS201801)購自武漢天植生物技術(shù)有限公司；對照品蘆薈大黃素苷(含量98%，批號：17103003)，大黃酸苷(含量98%，批號：17101705)及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(含量98%，批號：18080601)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。甲醇、磷酸均為色譜級(德國Merck公司)，水為超純水，其他試劑均為分析級。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters CORTECS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)，流動相：甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，洗脫梯度：0～5 min，3%～21%A；5～20 min，21%～40%A；20～27 min，40%～50%A；27～40 min，50%～58%A；40～50 min，58%～95%A；50～53 min，95%～3%A；流速：0.25 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取各批次大黃藥材(過4號篩)0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率50 kHz)處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備

分別精密稱取各對照品適量，加甲醇制成含沒食子酸、兒茶素、蘆薈大黃素苷、大黃酸苷、番瀉苷B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷A、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-1-O-葡萄糖苷、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為1.377、1.783、0.440、0.300、0.689、0.300、0.470、0.324、0.373、0.228、0.706、0.736、1.258、0.346 g/L的對照品儲備液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以2號峰(蘆薈大黃素苷)為參照峰，計算各對照品相對峰面積的RSD在0.62%～1.20%之間，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批掌葉大黃藥材(Z19)6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，以2號峰(蘆薈大黃素苷)為參照峰，計算各共有峰相對峰面積RSD在0.86%～2.23%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(Z19)，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，以2號峰(蘆薈大黃素苷)為參照峰，計算各共有峰相對峰面積的RSD在0.92%～2.30%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 對照圖譜建立及相似度評價 按照“2.1”項下確定的色譜條件及“2.2”項下的供試品溶液的制備方法，測定51批大黃的指紋圖譜。將23批掌葉大黃、19批藥用大黃及9批唐古特大黃指紋圖譜分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)》進(jìn)行分析，分別以Z1、Y1、T1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，采用中位數(shù)法，通過多點校正，全譜峰匹配，生成3種基原大黃對照指紋圖譜(圖1)及51批大黃指紋圖譜疊加圖(圖2)。以3種基原大黃的對照圖譜作為參照圖譜，得到23批掌葉大黃指紋圖譜相似度為0.819～0.982；19批藥用大黃中，除Y17、Y18相似度較低，其余樣品相似度在0.800～0.982之間；9批唐古特大黃圖譜相似度均大于0.900。表明不同產(chǎn)地、同一基原的大黃藥材所含化學(xué)成分具有較好的一致性。以掌葉大黃對照指紋圖譜作為藥用大黃、唐古特大黃參照圖譜導(dǎo)入軟件，計算得到19批藥用大黃的相似度在0.492～0.902之間。其中，Y6～Y8、Y11～Y15樣品與掌葉大黃相似度較高，大于0.800；9批唐古特大黃的相似度在0.592～0.700之間，相似度較低，結(jié)果見表2。

2.5.2 共有峰成分指認(rèn)及圖譜差異性分析 通過比較圖譜，從掌葉大黃、藥用大黃、唐古特大黃對照圖譜中分別標(biāo)定了33、25、35個共有峰，從3種基原大黃中標(biāo)定了18個共有峰(圖1)，并通過與對照品比對，指認(rèn)了其中14個成分，分別為沒食子酸(1號峰)、兒茶素(19號峰)、蘆薈大黃素苷(2號峰)、大黃酸苷(4號峰)、番瀉苷B(6號峰)、番瀉苷A(7號峰)、大黃酚-1-O-葡萄糖苷(10號峰)、大黃酚-8-O-葡萄糖苷(11號峰)、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(12號峰)、蘆薈大黃素(14號峰)、大黃酸(15號峰)、大黃素(16號峰)、大黃酚(17號峰)、大黃素甲醚(18號峰)。分析圖譜(圖1)可知，藥用大黃圖譜中的共有峰數(shù)目最少，保留時間在10～26 min之間，色譜峰響應(yīng)值較低，而唐古特大黃圖譜中色譜峰信息最為豐富，峰面積較大。與藥用大黃圖譜對比，掌葉大黃圖譜中增加了8個共有峰，分別為19～23號峰、26號峰、29～30號峰，其中，26、30號峰在藥用大黃中未檢測到，而藥用大黃圖譜中的36號峰在掌葉大黃中未檢測到。因此，建立的指紋圖譜可以較好地區(qū)分3種基原大黃。

注：A.混合對照品；B.掌葉大黃；C.藥用大黃；D.唐古特大黃; 1.沒食子酸；2.蘆薈大黃素苷；4.大黃酸苷；6.番瀉苷B；7.番瀉苷 A；10.大黃酚-1-O-葡萄糖苷；11.大黃酚-8-O-葡萄糖苷； 12.大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷；14.蘆薈大黃素；15.大黃酸； 16.大黃素；17.大黃酚；18.大黃素甲醚;19.兒茶素圖1 混合對照品及3種基原大黃對照圖譜

圖2 51批大黃疊加指紋圖譜

2.6 聚類分析

以掌葉大黃對照圖譜中的33個共有峰作為參照，將藥用大黃和唐古特大黃中無色譜峰信號的峰面積設(shè)置為0，得到51批大黃藥材33個色譜峰峰面積。將33個峰面積相對于稱樣量進(jìn)行量化,標(biāo)準(zhǔn)化處理導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 21.0軟件，采用Ward's方法和歐式距離進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖3。由聚類分析樹狀圖可知，51批大黃可分為3類，其中，Y1～Y19、Z20～Z23為Ⅰ類；Z1～Z19為Ⅱ類；T1～T9為Ⅲ類。當(dāng)分類距離為5時，Z20～Z23與Y6～Y8聚為一類，從產(chǎn)地信息中發(fā)現(xiàn)這些樣品均來源于四川，提示產(chǎn)于四川北川縣的掌葉大黃與產(chǎn)于四川平武縣的藥用大黃的化學(xué)成分較相似。通過分析發(fā)現(xiàn)這些藥用大黃的圖譜與掌葉大黃圖譜基本一致，僅部分色譜峰峰面積存在差異，提示部分藥用大黃與掌葉大黃兩者的圖譜相似度較高，因此，與掌葉大黃聚為一類。聚類分析結(jié)果與相似度評價結(jié)果一致。

表2 相似度分析結(jié)果

2.7 含量測定

為進(jìn)一步評價3個基原大黃的質(zhì)量，在建立指紋圖譜的基礎(chǔ)上，同時測定已指認(rèn)的14個化學(xué)成分的含量，并采用多元統(tǒng)計法，分析區(qū)別3種基原大黃的差異性化學(xué)成分。

2.7.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3”項下的對照品儲備液，加甲醇稀釋制得6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得到各個對照品的線性關(guān)系良好。將最低質(zhì)量濃度的對照品溶液進(jìn)行稀釋，分別以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10的對照品質(zhì)量濃度為檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果見表3。

2.7.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，14個對照品峰面積的RSD在0.13%～1.21%之間，表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批掌葉大黃藥材(Z19)6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算14個成分含量的RSD在0.97%～2.68%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(Z19)，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，測得14個成分峰面積的RSD在1.01%～2.39%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的大黃藥材(Z19)0.2 g，平行6份，加入與樣品中含量等量的對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率。測得14個成分平均加樣回收率為95.05%～105.10%，RSD<3%。表明該方法回收率良好。

圖3 聚類分析結(jié)果

表3 14個化學(xué)成分的回歸方程、線性范圍及LOD、LOQ

2.7.6 樣品測定 精密稱取51批大黃藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，得到含量測定結(jié)果，見表4。

2.8 多元統(tǒng)計分析

2.8.1 PCA 采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對含量測定結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用因子分析和主成分法，選擇相關(guān)性矩陣分析，計算主成分特征值、積累貢獻(xiàn)率。由表5可知，共提取了4個特征值大于1的主成分，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)85.823%。成分載荷矩陣反映各主成分與各項指標(biāo)變量之間的相互關(guān)系和作用的方向，載荷的絕對值越大對主成分的貢獻(xiàn)越大[8]。從表6可以看出，在第一主成分有較高載荷的成分為蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚；在第二主成分有較高載荷的成分為番瀉苷A。

表4 含量測定結(jié)果(mg·g-1)

(續(xù)表)

表5 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率

表6 主成分載荷矩陣

2.8.2 PLS-DA PLS-DA是一種無監(jiān)督的模型識別方法，采用PLS-DA進(jìn)行模式識別，可以尋找引起樣品之間差異的變量。因此，為進(jìn)一步尋找造成3種基原大黃之間差異的原因，在PCA的基礎(chǔ)上，將含量測定結(jié)果作為變量導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件進(jìn)行PLS-DA分析，得到的模型質(zhì)量參數(shù)R2X為0.715，R2Y為0.823，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.779。因此，本實驗所建立的模型預(yù)測效果較好。由PLS-DA得分圖(圖4)可以看出，3種基原大黃分布在不同的區(qū)域，表明該模型可以用于區(qū)別不同基原大黃，也進(jìn)一步說明不同基原大黃之間化學(xué)成分存在顯著的差異性。

運用統(tǒng)計推斷方法分析可驗證鑒別模型[9]，結(jié)果見圖5A。由圖可知，R2和Q2截距值分別為0.036 7和-0.362，所有位于左邊的R2和Q2值均低于其最右邊的值，且Q2的回歸線截距小于0，說明建立的PLS-DA模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，預(yù)測能力較好。采用變量重要性投影值(VIP)篩選造成3種基原大黃差異性的標(biāo)志物，其中VIP值大于1的成分有：大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷A、兒茶素、大黃酸苷、番瀉苷B、大黃酸，表明這6個化學(xué)成分是引起不同基原大黃差異的主要標(biāo)志性成分，結(jié)果見圖5B。

圖4 PLS-DA得分圖

注：1.沒食子酸；2.兒茶素；3.蘆薈大黃素苷；4.大黃酸苷；5.番瀉苷B；6.番瀉苷A； 7.大黃酚-1-O-葡萄糖苷；8.大黃酚-8-O-葡萄糖苷；9.大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷； 10.蘆薈大黃素；11.大黃酸；12.大黃素；13.大黃酚；14.大黃素甲醚圖5 PLS-DA模型置換驗證圖(A)及14個化學(xué)成分的VIP值(B)

3 討論

近年來，研究不同基原大黃的文獻(xiàn)眾多，但研究中普遍存在樣品量較少、藥材的來源不明確等問題[5,10-11]。本研究從3種大黃的道地產(chǎn)區(qū)及主產(chǎn)區(qū)收集多個批次的樣品進(jìn)行分析，通過保證藥材來源的道地性和代表性，使研究結(jié)果具有客觀性和普遍性，提高了研究的參考價值。在收集唐古特大黃藥材的過程中，發(fā)現(xiàn)3批偽品大黃，其指紋圖譜與其他樣品差異性較大，與對照圖譜的相似度均低于0.30，且在圖譜中檢測到土大黃苷，而幾乎檢測不到大黃酸和番瀉苷A、番瀉苷B，這與逄瑜等[7]的研究結(jié)論一致。因此，本研究所建立的方法還可為大黃藥材真?zhèn)蔚蔫b別提供依據(jù)。

大黃含有的化學(xué)成分復(fù)雜，采用HPLC法建立指紋圖譜存在分析時間過長、色譜峰分離效果不佳等問題[6,12]。本實驗采用UPLC建立了可在較短時間內(nèi)實現(xiàn)指紋圖譜分析和多個化學(xué)成分含量測定的方法。建立的對照指紋圖譜色譜峰分離度良好，共有峰數(shù)目較多，可以為基原鑒別提供依據(jù)。相似度評價結(jié)果表明，唐古特大黃可與其他2個基原大黃明顯區(qū)分。但部分藥用大黃圖譜與掌葉大黃圖譜總體峰形特征相似，相似度較高。多個批次藥材的含量測定結(jié)果也表明，藥用大黃中所含的多個游離蒽醌類化合物含量高于掌葉大黃，這與相關(guān)文獻(xiàn)研究中藥用大黃的整體圖譜色譜峰峰面積小、質(zhì)量較差，掌葉大黃所含游離蒽醌類化合物的含量高于藥用大黃的結(jié)論不一致[5,13-14]。由于藥用大黃產(chǎn)量少，較難收集[14-15]，研究中涉及的藥用大黃樣品較少，3種基原大黃質(zhì)量優(yōu)劣的結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)論不一。因此，在正品大黃中藥用大黃的品質(zhì)還有待進(jìn)一步深入研究。

PLS-DA分析與聚類分析相比，可將51批大黃分為3類，分類效果顯著。在目前大黃的研究中，關(guān)于不同基原大黃的差異成分報道較少，本研究通過PLS-DA篩選出不同基原大黃之間的差異性成分，但篩選出的主要差異性成分尚需要作進(jìn)一步藥理研究，明確藥效上的差別。