李春芬，何贊贊，楊龍斌，何長(zhǎng)生，占松鶴，孫 裴，魏建忠，李 郁

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.巢湖市畜牧獸醫(yī)中心，安徽 巢湖 238000；3.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 合肥 230091）

豬偽狂犬病（Pseudorabies, PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的一種高度接觸性傳染病[1]。一般成年豬呈隱性感染，可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，種豬不育，15日齡內(nèi)的仔豬病死率高，肥育豬呼吸困難、生長(zhǎng)停滯、增重緩慢等。PR呈世界性分布，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將PR列為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將PR列為二類動(dòng)物疫病，同時(shí)PR也是我國(guó)《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》中優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病，要求到2020年底全國(guó)所有種豬場(chǎng)達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。

疫苗免疫接種是預(yù)防和控制PR的根本措施，以凈化豬群為主要手段。20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著PR基因缺失疫苗（Bartha-K61株）的引入并廣泛使用，PR在我國(guó)大部分地區(qū)得到有效控制[2]。但自2011年以來(lái)，我國(guó)各地均有PR疫情的報(bào)道[3-5]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。安徽地區(qū)豬群中PRV的感染率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[6-7]，可臨床流行毒株的致病性、與疫苗株之間的匹配性等目前尚不清楚。本研究在從安徽不同地區(qū)疑似PRV感染病豬中分離鑒定的13株P(guān)RV基礎(chǔ)上，以小鼠為動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)13株P(guān)RV安徽分離株的半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定、病理剖檢和病理組織學(xué)觀察以及各組織臟器的病毒載量檢測(cè)，了解和掌握PRV安徽分離株的毒力特征，從而為深入研究PRV安徽分離株的抗原性奠定基礎(chǔ)，為安徽地區(qū)PR的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2016年1月至2018年12月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室進(jìn)行。

1.2 毒株、細(xì)胞及試驗(yàn)動(dòng)物

13株P(guān)RV安徽分離株（代號(hào)為AH1601～AH1604、AH1701～AH1704、AH1801～AH1805）由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室分離、鑒定[8]；Vero細(xì)胞由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室保存；455只體重為18～22 g清潔級(jí)昆明雌性小鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液、2×SuperStar Plus High-GC PCR Mix、DL 2000 DNA Marker。熒光定量PCR儀、PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)、超高速離心機(jī)。

1.4 半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定

在13株P(guān)RV安徽分離株中，每株為1組，共計(jì)13組（編號(hào)為1～13）。以第1組（代號(hào)為AH1601的PRV安徽分離株）為例說(shuō)明。將AH1601半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50% tissue culture infective dose, TCID50）為106/mL進(jìn)行10倍遞增稀釋，取6個(gè)不同釋梯度（106～101TCID50）的病毒液編號(hào)為1A～1F。35只小鼠隨機(jī)分成7組（編號(hào)1A～1F和G），每組5只。試驗(yàn)組1A～1F，頸部皮下注射對(duì)應(yīng)的不同稀釋度PRV，0.1 mL/只；對(duì)照組G，以相同的接種途徑和劑量注射DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。在適宜環(huán)境下每組小鼠分別隔離飼養(yǎng)。持續(xù)觀察1周并記錄小鼠的精神狀態(tài)及死亡情況，按照Reed-Muench法計(jì)算AH1601的LD50。

1.5 病理剖檢及病理組織學(xué)觀察

經(jīng)1.4攻毒后觀察各組小鼠精神狀態(tài)，分別取第1～13組PRV攻毒劑量為106TCID50（試驗(yàn)A組）小鼠，依次標(biāo)記為1A～13A，對(duì)照組小鼠標(biāo)記為G，剖檢小鼠觀察各臟器病變，并采集小鼠的腦組織及肺、肝、脾和腎臟于10%福爾馬林溶液中，24 h后重新更換福爾馬林，進(jìn)行固定和保存，之后送至安徽醫(yī)科大學(xué)制備病理組織切片，顯微鏡觀察，比較各組織病變程度。

1.6 感染小鼠各組織臟器中PRV載量的檢測(cè)

經(jīng)1.4攻毒后，分別取第1～13組PRV攻毒劑量為106TCID50（試驗(yàn)A組）小鼠，采其腦組織及肺、肝、脾和腎臟于1.5 mL研磨管，稱重記錄（各組織重約100 mg），按照一定體積比（1∶5）加入無(wú)菌PBS緩沖液進(jìn)行研磨，提取各組織核酸，利用安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測(cè)PRVgE基因的方法，對(duì)各臟器組織進(jìn)行PRV載量的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LD50的測(cè)定結(jié)果

1 3株P(guān)RV安徽分離株對(duì)小鼠的LD50在102.569～105.167TCID50之間，不同毒株對(duì)小鼠致病力大小各有差異，其中AH1802和AH1803對(duì)小鼠的致病力最強(qiáng)，LD50分別為102.569TCID50和102.833TCID50，AH1603和AH1703對(duì)小鼠的致病力最弱，LD50均為105.167TCID50（表1）。

表1 13株P(guān)RV安徽分離株對(duì)小鼠的LD50測(cè)定結(jié)果

2.2 病理剖檢及病理組織學(xué)觀察結(jié)果

在LD50的測(cè)定中，對(duì)照組小鼠均健活，試驗(yàn)組小鼠死前出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、呼吸加快等現(xiàn)象。部分小鼠出現(xiàn)典型的PR癥狀：奇癢、啃咬注射部位，致使局部被毛脫落、皮膚出血，隨后四肢麻痹，倒地不起，最后衰竭死亡。剖檢死亡小鼠可見(jiàn)肝、脾、肺、腎臟及腦等部位均有不同程度的出血、腫大，對(duì)照組無(wú)異常變化。病理組織HE檢查結(jié)果如下。

2.2.1 腦部 對(duì)照組G結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理變化。試驗(yàn)組1A、3A未見(jiàn)明顯病理變化；2A少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；4A腦血管輕微充血；5A、7A、8A少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；6A輕微病毒性腦炎；9A大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腦水腫；10A病毒性腦炎，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；11A病毒性腦炎，腦水腫；12A輕微腦炎，出血；13A病毒性腦炎，腦水腫（圖1）。結(jié)果表明，AH1801、AH1802、AH1803感染小鼠腦組織病理變化較為嚴(yán)重。

2.2.2 肺臟 對(duì)照組G整體結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁無(wú)明顯增厚，組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。試驗(yàn)組1A輕微出血，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；2A炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚；3A少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；4A肺動(dòng)脈充血；5A炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；6A、9A肺泡壁輕微增厚；7A肺泡腔變??；8A肺動(dòng)脈血管充血，組織間隙輕微出血；10A肺臟出血、肺泡內(nèi)出血；11A炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；12A肺動(dòng)脈充血，肺泡壁增厚；13A肺臟出血，彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。結(jié)果表明，AH1802、AH1803、AH1804、AH1805感染小鼠肺臟組織病理變化較為嚴(yán)重。

圖1 各組小鼠腦組織病理組織學(xué)觀察（HE染色，20×）

圖2 各組小鼠肺臟病理組織學(xué)觀察（HE染色，20×）

2.2.3 肝臟 對(duì)照組G整體結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈輪廓清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿，肝索沿著中央靜脈放射狀排列。試驗(yàn)組1A淤血；2A中央靜脈充血；3A無(wú)特征性明顯病變；4A肝竇間隙輕微增寬，組織少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；5A少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；6A炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；7A出血，充血；8A少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；9A充血；10A肝細(xì)胞排列紊亂，空泡性變性；11A炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝水腫；12A肝竇間隙輕微增寬；13A少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3）。結(jié)果表明，AH1702、AH1802、AH1803感染小鼠肝臟組織病理變化較為嚴(yán)重。

圖3 各組小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察（HE染色，20×）

2.2.4 脾臟 對(duì)照組G整體結(jié)構(gòu)正常，脾小結(jié)結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯增大縮小，紅髓白髓界限分明，無(wú)明顯壞死，淋巴細(xì)胞無(wú)明顯變性壞死，組織未見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。試驗(yàn)組1A、7A、9A無(wú)明顯特征性病變；2A、3A、8A少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；4A淤血；5A出血；6A紅細(xì)胞浸潤(rùn)；10A紅髓白髓界限不清；11A中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；12A結(jié)締組織增生；13A淋巴細(xì)胞增生，紅細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4）。結(jié)果表明，AH1701、AH1802、AH1803感染小鼠脾臟組織病理變化較為嚴(yán)重。

圖4 各組小鼠脾臟病理組織學(xué)觀察（HE染色，20×）

2.2.5 腎臟 對(duì)照組G整體結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞明顯脫落水腫，腎小球結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。試驗(yàn)組1A少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；2A、4A腎小管上皮細(xì)胞空泡性變性；3A血管充血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；5A腎小球輕微出血；6A輕微出血；7A腎小管上皮細(xì)胞空泡性變性；8A無(wú)明顯病理變化；9A組織間隙少量出血；10A出血；11A血管充血；12A腎小管上皮細(xì)胞空泡性變性，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；13A大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間隙輕微出血（圖5）。結(jié)果表明，AH1703、AH1802、AH1803、AH1804感染小鼠腎臟組織病理變化較為嚴(yán)重。

圖5 各組小鼠腎臟病理組織學(xué)觀察（HE染色，20×）

2.3 感染小鼠各組織臟器中PRV載量的檢測(cè)結(jié)果

13株P(guān)RV安徽分離株在感染小鼠各組織臟器中的病毒載量因不同毒株、不同臟器存在差異。試驗(yàn)組第1～9、12～13組肝臟病毒含量顯著低于第10、11組（P＜0.05），第10組顯著低于第11組（P＜0.05），第11組病毒含量最高；第1～9、12～13組脾臟病毒含量顯著低于第10、11組（P＜0.05），第11組顯著低于第10組（P＜0.05），第10組病毒含量最高；第1～6、8、9、11～13組肺臟病毒含量顯著低于第7、10組（P＜0.05），第7組顯著低于第10組（P＜0.05），第10組病毒含量最高；第2、3、5、8、9、11、13組間腎臟組織病毒含量以及第4、6、10、12組間腎臟組織病毒含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），但均顯著低于第7、1組（P＜0.05），第7組與第1組差異不顯著（P＞0.05），第1組病毒含量最高；第1～7、9、12～13組腦組織病毒含量均顯著低于第8、10、11組（P＜0.05），第8組顯著低于第10組（P＜0.05），第10組顯著低于第11組（P＜0.05），第11組病毒含量最高。結(jié)果表明，AH1802和AH1803感染小鼠肝臟、脾臟、腦中的病毒含量顯著高于其他11株（P＜0.05），AH1703和AH1802在肺臟中的病毒含量顯著高于其他11株（P＜0.05），AH1703、AH1704和AH1804在腦和肺臟中的病毒含量均顯著高于肝臟、脾臟和腎臟（表2）。

表2 13株P(guān)RV分離株攻毒后小鼠各組織病毒載量的測(cè)定結(jié)果 ng/μL

3 討論

PR具有傳播快、病死率高、流行范圍廣、傳播途徑多、病原體頑固等特點(diǎn)。自2011年以來(lái)，我國(guó)多省免疫過(guò)PRV基因缺失疫苗（Bartha-k61株）的豬群均出現(xiàn)PR疫情，其主要表現(xiàn)為突發(fā)性大面積母豬流產(chǎn)，肥育豬致死性感染，豬群gE抗體陽(yáng)性率突然升高。有研究表明，此PR的暴發(fā)是由PRV變異株引起[9]。新的PRV流行株在多個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生了抗原變異，變異株與經(jīng)典株屬于兩個(gè)不同的進(jìn)化分支，且Bartha-k61株疫苗不能對(duì)變異株的攻擊提供完全抵抗[10-11]。2012年以來(lái)，安徽省部分地區(qū)也相繼發(fā)生PR。李春芬等[7]對(duì)2013—2017年安徽部分地區(qū)22 130份血清樣品進(jìn)行PRV-gE抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示豬群PRV感染呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。袁獻(xiàn)宇等[8]從2016—2018年安徽臨診病例中共分離鑒定了15株P(guān)RV，其主要毒力基因核苷酸序列均與2011年國(guó)內(nèi)PRV變異株同源性較高，變異株已成為安徽省主要的流行毒株。面對(duì)PRV變異株的廣泛流行，對(duì)PRV變異株進(jìn)行致病性研究，了解流行毒株的特征，對(duì)于提出科學(xué)有效的防制措施具有重要意義。

因PRV感染豬、羊及小鼠組織病理學(xué)病變相似，且小鼠感染PRV強(qiáng)毒株后病理變化明顯[11]，故本研究以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物模型。PRV只有1個(gè)血清型，不同毒株在毒力和生物學(xué)特性等方面存在差異。本研究LD50測(cè)定結(jié)果顯示，13株P(guān)RV的LD50在102.569～105.167TCID50之間，其中AH1802和AH1803的LD50分別為102.569TCID50和102.833TCID50，AH1603和AH1703的LD50均為105.167TCID50，表明PRV安徽分離株之間的毒力存在差異，AH1802和AH1803對(duì)小鼠的致病力最強(qiáng)，AH1603和AH1703對(duì)小鼠的致病力最弱。病理學(xué)結(jié)果顯示，小鼠肝、脾、肺、腎臟和腦等部位均有不同程度的出血、腫大，但各組織的病變程度因不同毒株而異，其中AH1802、AH1803引起的病變較其他毒株嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為病毒性腦炎、腦水腫，肺、肝臟出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，脾臟紅白髓界限不清，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟出血等，進(jìn)一步表明源自安徽不同地區(qū)的13株P(guān)RV毒力不同。

不同毒力PRV毒株感染后在機(jī)體內(nèi)的分布存在差異，強(qiáng)毒株廣泛分布于全身，而弱毒株和中等毒力毒株在體內(nèi)的擴(kuò)散只局限在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）[12]。本研究13株P(guān)RV經(jīng)頸部皮下攻毒小鼠，試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、呼吸加快等現(xiàn)象，部分小鼠出現(xiàn)奇癢、啃咬注射部位等典型PR癥狀后不久死亡；發(fā)病和死亡小鼠多個(gè)組織器官均出現(xiàn)明顯病理變化，且從發(fā)病和死亡小鼠的腦部、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等組織均檢測(cè)出PRV核酸，而對(duì)照組小鼠則均健活，且組織器官未呈現(xiàn)異常變化，表明13株P(guān)RV在發(fā)病和死亡小鼠體內(nèi)分布廣泛，對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性。

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，13株P(guān)RV在感染小鼠各組織中的病毒載量因不同毒株、不同臟器而各有不同，其中AH1802和AH1803感染小鼠在腦、肝臟、脾臟中的病毒載量顯著高于其他11株（P＜0.05），AH1703和AH1802在肺臟中的病毒載量顯著高于其他11株（P＜0.05），AH1601在腎臟中的病毒載量最高，AH1703、AH1704和AH1804在腦和肺臟中的病毒載量顯著高于肝臟、脾臟和腎臟，這或與毒株來(lái)源于不同地區(qū)、毒株本身發(fā)生變異和PRV在小鼠內(nèi)的侵染途徑不同有關(guān)，究其原因需要進(jìn)一步地深入研究。

綜上表明13株P(guān)RV均對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性，且AH1802和AH1803對(duì)小鼠的致病性強(qiáng)于其他毒株。針對(duì)PR的防控策略，在重視和加強(qiáng)疫苗免疫的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)毒株遺傳變異研究，針對(duì)性地進(jìn)行疫苗研發(fā)才是控制PR的關(guān)鍵。本研究不僅豐富了安徽PR流行病學(xué)資料，為進(jìn)一步研究PRV安徽分離株的抗原性奠定基礎(chǔ)，也為安徽地區(qū)PR的有效防控提供了科學(xué)依據(jù)。