鄒平安 徐 楠 陶志偉 王 熙 劉 哲 余騰驊

骨肉瘤是臨床上最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于10～20歲青少年。盡管外科手術(shù)、化療、放療等綜合治療手段已使骨肉瘤患者的5年生存率獲得較為顯著的提高，但早期骨肉瘤的治療方法仍以截肢為主，對(duì)患者的身體及心理造成了極為嚴(yán)重的傷害。臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示，約20%的骨肉瘤患者初診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中肺轉(zhuǎn)移占90%[1]?；熓桥R床控制腫瘤肺部轉(zhuǎn)移的主要手段，遺憾的是，超過70%伴有肺轉(zhuǎn)移的患者對(duì)化療反應(yīng)較差，化療產(chǎn)生的毒性作用更是危及患者生命[2]。目前，雖有大量研究對(duì)骨肉瘤患者的臨床治療方案進(jìn)行積極探索，如免疫治療[3]、抗血管生成治療[4]等，但均未獲得滿意的療效。因此，尋找新的治療模式進(jìn)而提高骨肉瘤患者的預(yù)后及生活質(zhì)量迫在眉睫。

研究發(fā)現(xiàn)，雌/孕激素受體(estrogen/progesterone receptor，ER/PR)在骨肉瘤組織及細(xì)胞中呈現(xiàn)一定比例的表達(dá)[5-6]，且體外雌激素可刺激骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)，應(yīng)用雌激素受體阻斷劑可部分抑制其增殖效應(yīng)[7]。結(jié)合患者處于性激素旺盛期的疾病好發(fā)年齡，強(qiáng)烈提示骨肉瘤發(fā)生發(fā)展可能與激素受體的異?；罨嚓P(guān)。研究團(tuán)隊(duì)前期大量的數(shù)據(jù)證實(shí)，G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)是除ER、PR外的第三種獨(dú)立作用的雌激素受體，且在多種正常細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞系中均證實(shí)GPER可獨(dú)立介導(dǎo)活化后的下游雌激素效應(yīng)，提示GPER可能是預(yù)測(cè)多種腫瘤患者臨床預(yù)后與治療敏感性的有效生物學(xué)指標(biāo)[8-12]。然而，目前GPER在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚屬于研究“盲點(diǎn)”。因此，本研究擬利用GPER特異性激動(dòng)劑(G1)[10-12]及GPER特異性拮抗劑(G15)[10-12]等小分子化合物首次探討GPER特異性活化對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人成骨細(xì)胞系hFOB1.19與骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、HOS、SW1353購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，南美胎牛血清(Gibco公司)。G1與G15(Sigma公司)，DAPI與FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋公司)，總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，熒光定量PCR試劑盒(BioTeKe公司)，GPER、cyclinA、cyclinD1、Actin抗體(Abcam公司)，CCK-8試劑盒(碧云天公司)。流式細(xì)胞儀(FACS Callur)，二氧化碳培養(yǎng)箱(BECKMEN公司)，多功能酶標(biāo)儀、全自動(dòng)熒光PCR分析儀和穩(wěn)壓 DNA電泳儀(Bio-Rad公司)，熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) hFOB1.19、MG-63、HOS與SW1353細(xì)胞均培養(yǎng)于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)，隔日換液，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%左右時(shí)用0.25%胰酶消化離心后傳代。

1.2.2 數(shù)據(jù)庫分析 使用生物信息學(xué)技術(shù)分析在線腫瘤基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)集(https：//tnmplot.com/analysis/)內(nèi)骨肉瘤組織和鄰近正常組織中GPER基因表達(dá)差異(其中骨肉瘤組織88例，正常組織564例)。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)GPER mRNA表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hFOB1.19、MG-63、HOS與SW1353細(xì)胞，用Trizole試劑提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)均按照TaKaRa試劑盒及熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行操作。GPER上游引物序列為5’-ACGAGACTGTGAAATCCGCAACCA-3’，下游引物序列為5’-ATCAGGCTGGAGGTGCACTTGGAA-3’；以β-Actin為內(nèi)參對(duì)照，上游引物序列為5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游引物序列為5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)GPER、cyclinA及cyclinD1蛋白表達(dá) GPER蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中臨床新鮮組織樣本、成骨細(xì)胞系及骨肉瘤細(xì)胞系無需藥物處理，按相應(yīng)試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測(cè)。骨肉瘤SW1353細(xì)胞處理如下：待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%密度，無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，依照實(shí)驗(yàn)分組加入100 nmol/L G1和/或1 μmol/L G15處理12 h，各組調(diào)整DMSO至一致，處理相應(yīng)時(shí)間后立即終止，PBS洗3次，最后將細(xì)胞移入EP管中。收集組織/細(xì)胞、細(xì)胞總蛋白提取、測(cè)蛋白濃度、制膠、上樣(200 μg)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(稀釋比例均為1∶500)、二抗(山羊抗鼠/兔 IgG，1∶1000)孵育、ECL化學(xué)發(fā)光成像，Quantity one軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)SW1353細(xì)胞中GPER表達(dá)定位 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SW1353細(xì)胞胰酶消化離心重懸后以3×105/ml接種于底部放有小玻片的24孔板中，置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及密度合適后，取出24孔板用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛200 μL固定20 min，PBS洗3次，10%山羊血清37℃封閉30 min，加入GPER抗體(1∶50稀釋)30～40 μL，4℃孵育過夜，PBS洗3次，暗室中加入FITC熒光二抗(1∶100)，37℃ 60 min，PBS洗3次，加入DAPI(1∶10)染核5 min，PBS洗3次，每次5 min，封片后于暗處倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 CCK-8法檢測(cè)SW1353細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1353細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基饑餓12 h后分別加入不同濃度(10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L與1 μmol/L)的G1或100 nmol/L G1和/或1 μmol/L G15處理上述細(xì)胞24 h，各組調(diào)整DMSO至一致。24 h后倒出培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8試劑，細(xì)胞孵箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(OD值)，波長(zhǎng)選擇450 nm，獲得各組相對(duì)細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)SW1353細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1353細(xì)胞接種于6孔板中，至腫瘤細(xì)胞密度達(dá)到約50%，移去培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，使各組細(xì)胞周期同步于G0/G1期。分別加入100 nmol/L G1和/或1 μmol/L G15處理細(xì)胞24 h，各組調(diào)整DMSO至一致，24 h后收獲SW1353細(xì)胞，70%乙醇固定，置于4℃冰箱過夜，PI染色避光室溫孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中各細(xì)胞周期中DNA的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GPER在骨肉瘤組織中的表達(dá)

應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)分析骨肉瘤組織(Tumor，n=88)及正常組織(Normal，n=564)中GPER的基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示GPER在骨肉瘤組織中的基因表達(dá)量顯著升高(P<0.001，圖1A)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了臨床3例新鮮樣本中骨肉瘤組織(C)與正常組織(N)的GPER蛋白表達(dá)量，結(jié)果同樣顯示GPER在腫瘤組織中的表達(dá)量明顯高于與之對(duì)應(yīng)的正常組織(P<0.05，圖1B)。

A：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)GPER在骨肉瘤組織與正常組織中的基因表達(dá)水平(P<0.001，與Normal組比較)；B：Western blot檢測(cè)GPER在3例臨床骨肉瘤組織與正常組織中的蛋白表達(dá)水平(a為與Normal組比較，P<0.05)。

2.2 骨肉瘤SW1353細(xì)胞系是良好的GPER體外研究模型

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，3種骨肉瘤MG-63、HOS與SW1353細(xì)胞系中GPER mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常成骨hFOB1.19細(xì)胞系，且在SW1353細(xì)胞系中表達(dá)量最高(P<0.05，圖2A)。Western blot檢測(cè)亦獲得了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(P<0.05，圖2B)，提示骨肉瘤SW1353細(xì)胞系是良好的、穩(wěn)定的后續(xù)GPER體外研究模型。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示GPER主要表達(dá)于SW1353細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞膜表達(dá)量較低(圖2C)。

A-B：熒光定量PCR(A)與Western blot(B)分別檢測(cè)正常成骨hFOB1.19細(xì)胞系與骨肉瘤MG-63、HOS與SW1353細(xì)胞系中GPER mRNA與蛋白的表達(dá)水平；a：P<0.05，與hFOB1.19細(xì)胞比較；b：P<0.05，與MG-63細(xì)胞比較；c：P<0.05，與HOS細(xì)胞比較。C：細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)骨肉瘤SW1353細(xì)胞系中GPER的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位情況(MERGE為兩者融合圖像，放大倍數(shù)400，標(biāo)尺50 μm)。

2.3 G1特異性活化GPER對(duì)骨肉瘤SW1353細(xì)胞增殖的影響

G1藥物濃度梯度實(shí)驗(yàn)(CCK-8實(shí)驗(yàn))顯示，100 nmol/L G1對(duì)SW1353細(xì)胞增殖有最佳的促進(jìn)效應(yīng)，而藥物濃度進(jìn)一步提升后，500 nmol/L與1 μmol/L G1將表現(xiàn)出一定的藥物毒性，使SW1353細(xì)胞增殖能力減低(P<0.05，圖3A)。此外，應(yīng)用G15特異性拮抗GPER活性后，100 nmol/L G1誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.05，圖3B)。以上數(shù)據(jù)均提示，G1特異性活化GPER能促進(jìn)骨肉瘤SW1353細(xì)胞增殖，且最佳藥物作用濃度為100 nmol/L。

A：不同濃度的G1處理24 h后對(duì)骨肉瘤SW1353細(xì)胞增殖的影響；a：P<0.05，與對(duì)照組比較。B：不同藥物組合處理24 h后對(duì)骨肉瘤SW1353細(xì)胞增殖的影響；a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與G1+G15組比較。

2.4 G1特異性活化GPER對(duì)骨肉瘤SW1353細(xì)胞周期進(jìn)展的促進(jìn)作用

流式細(xì)胞學(xué)分析顯示，G1可明顯增加SW1353細(xì)胞周期中DNA合成期(S期)細(xì)胞比例(P<0.05，圖4A)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展；與之相符的是，G1同時(shí)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinA與cyclinD1的表達(dá)量(P<0.05，圖4B)，以上效應(yīng)均可被G15所阻斷(P<0.05，圖4A-B)。

A-B：G1特異性活化GPER顯著提高骨肉瘤SW1353細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比例(A)，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinA與cyclinD1的表達(dá)(B)；a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與G1+G15組比較。

3 討論

目前，少有研究證實(shí)雌激素受體介導(dǎo)的特異性活化可調(diào)節(jié)骨肉瘤臨床進(jìn)展，而有關(guān)新型雌激素受體GPER在骨肉瘤中的表達(dá)情況及其潛在生物學(xué)效應(yīng)更是未知之?dāng)?shù)。為此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行此次研究，我們驚喜的發(fā)現(xiàn)GPER在骨肉瘤組織(體內(nèi))及骨肉瘤細(xì)胞系(體外)中均呈現(xiàn)高表達(dá)，在骨肉瘤SW1353細(xì)胞系中表達(dá)水平最高，其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)主要定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中；特異性激動(dòng)劑G1可通過活化GPER顯著促進(jìn)骨肉瘤SW1353細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展。結(jié)合本研究結(jié)果及團(tuán)隊(duì)的前期發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)GPER有望在未來成為骨肉瘤較好的潛在治療靶點(diǎn)之一。

既往研究發(fā)現(xiàn)，大約20%的人類癌癥與GPER的表達(dá)及功能狀態(tài)相關(guān)[13]。然而，近年來大量報(bào)道顯示GEPR在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚存在一定爭(zhēng)議。在表達(dá)水平方面，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)GPER在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種消化道惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平較正常組織顯著降低[8-9]。相反，在ER+他莫昔芬耐藥乳腺癌[10]、三陰性乳腺癌[12]、卵巢癌[14]等惡性腫瘤中，GPER在腫瘤組織中的表達(dá)量卻顯著升高。本研究也得到了類似的結(jié)果，GPER無論在臨床樣本組織中還是體外細(xì)胞系水平上，其在骨肉瘤中的表達(dá)量均顯著高于正常組織或細(xì)胞，這提示GPER在骨肉瘤的惡性進(jìn)展中可能扮演著促癌的關(guān)鍵因素。

我們?cè)陔S后的細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)：GPER的特異性活化可顯著增加骨肉瘤SW1353細(xì)胞周期中S期的細(xì)胞比例，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，且導(dǎo)致快速的細(xì)胞生長(zhǎng)，應(yīng)用GPER特異性拮抗劑G15則逆轉(zhuǎn)以上變化。上述骨肉瘤中GPER介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)與研究團(tuán)隊(duì)前期在三陰性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的作用極為相似[10-12]，兩者同為極度惡性的腫瘤亞型，這將有助于我們?cè)谖磥砀钊氲奶接慓PER在骨肉瘤中的具體生物學(xué)功能。有趣的是，本研究應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光方法還發(fā)現(xiàn)GPER可表達(dá)于骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)兩種不同的亞細(xì)胞位置：細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，這與我們前期在乳腺癌微環(huán)境腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast，CAFs)中所得到的結(jié)果一致，即GPER可定位于CAFs的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，分別特異性的介導(dǎo)下游GPER/ERK及GPER/PKA信號(hào)通路的活化[11]，提示GPER在骨肉瘤中不同的亞細(xì)胞定位可能會(huì)發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，然而這還有待更多的臨床樣本及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。

細(xì)胞周期蛋白cyclinA與cyclinD1過表達(dá)時(shí)，可顯著縮短細(xì)胞周期中G1期的比例，促使細(xì)胞提前進(jìn)入S期進(jìn)行大量的DNA合成，引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控。有研究報(bào)道，骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中伴有顯著的cyclinA與cyclinD1過表達(dá)現(xiàn)象，提示以上兩種細(xì)胞周期蛋白的過表達(dá)對(duì)骨肉瘤的惡性進(jìn)展具有重要意義[15-16]。同時(shí)，有學(xué)者提出GPER特異性活化介導(dǎo)的EGFR/ERK信號(hào)通路下游可以定位于cyclinA與cyclinD1的啟動(dòng)子區(qū)域促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄及翻譯從而出現(xiàn)腫瘤異常生長(zhǎng)[17]。我們用GPER特異性激動(dòng)劑G1處理骨肉瘤SW1353細(xì)胞12 h后，Western blot方法檢測(cè)到cyclinA與cyclinD1的蛋白表達(dá)量明顯增加，而在G1聯(lián)合G15的處理組中，兩者的表達(dá)均被顯著抑制，說明骨肉瘤中GPER特異性活化可能通過調(diào)控下游信號(hào)通路靶向cyclinA與cyclinD1過度表達(dá)，進(jìn)而表現(xiàn)細(xì)胞周期進(jìn)展及細(xì)胞過度生長(zhǎng)的惡性生物學(xué)行為，但是具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，作為獨(dú)立作用的新型雌激素受體，本研究結(jié)果首次揭示GPER的特異性活化在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的潛在功能，靶向GPER有望成為提高患者臨床預(yù)后的新思路，但這還需要更多的體內(nèi)及臨床實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證與支持。