崔貴梅，李小波，馬 樾，郝曜山，張歡歡，孫 毅

（1山西大豐種業(yè)有限公司，太原 030031；2山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，太原 030031）

0 引言

轉基因玉米商業(yè)化在中國尚未開放，只允許在批準的范圍內和可控條件下開展轉基因玉米試驗研究。隨著國際和國內轉基因玉米研究的快速發(fā)展，國內非法種植轉基因玉米的現(xiàn)象層出不窮[1]，國內農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門對農(nóng)作物轉基因實施監(jiān)管的力度也在加大。加強農(nóng)作物轉基因檢測和執(zhí)法力度，防止轉基因漂移對于保護中國生物技術育種的健康發(fā)展、生物多樣性和農(nóng)業(yè)生態(tài)安全都是至關重要的。

由于玉米屬于高異交受粉作物，花粉的擴散距離受玉米揚花期的氣象和地理條件影響，不同地方研究得出的結果差別較大[2-6]，借助風力及大氣湍流玉米花粉傳播距離可達800～1000 m以上[7-8]，常規(guī)玉米被非預期轉基因漂移影響的可能性較大。歐洲2001—2010年期間在包括德國、瑞士和比利時在內的多個歐洲國家的216個地點進行的一系列大規(guī)模試驗調查發(fā)現(xiàn)[9]，花粉來源最遠的距離為4.45 km。在該研究中他們建議，在德國勃蘭登堡州將Bt轉基因玉米種植的緩沖帶從100 m（2007年）擴大到800～1000 m。在中國，目前農(nóng)業(yè)轉基因生物安全監(jiān)管制度規(guī)定轉基因玉米隔離距離為300 m[10]。此外，異地材料資源共享，在常規(guī)玉米選育工作者之間交流頻率也較高，未知因素造成轉基因種子非預期擴散的可能性時有發(fā)生。因此，對非預期轉基因漂移的檢測十分重要。除了各地農(nóng)業(yè)農(nóng)村局科教處等專職檢查部門抽查檢測外，育種者自查自檢是預防此問題發(fā)生的主要途徑。

海南省南部的三亞、樂東、陵水三市縣及周邊地區(qū)，已經(jīng)成為中國重要的育種基地。鑒于南繁的特殊性，這一地區(qū)在冬季育種單位集中，轉基因漂移潛在風險高于全國其他地區(qū)，因而轉基因生物安全在南繁地區(qū)備受關注[11-12]。使用轉基因蛋白免疫層析快速檢測試紙條，是目前最簡便又行之有效的方法。按照適當?shù)牟蓸硬襟E，試紙條可以在給定的一批樣品中以99%的置信水平檢測出少于0.15%的轉基因成分[13]。本研究從常規(guī)玉米育種者自查角度，根據(jù)多年實踐經(jīng)驗，總結玉米轉基因快速檢測試紙條使用的具體方法和操作步驟，希望能為廣大玉米育種工作者提供參考。

1 材料和方法

1.1 檢測試驗用品

購買轉基因快速檢測試紙條，分為檢測多種基因類型的試紙條，國內目前常用的主要有3種（如圖1-A）：分別是檢測轉抗蟲基因BtCryⅠAb/Ac、檢測轉抗除草劑草甘膦Cp4 EPSPS基因和檢測抗除草劑草銨膦Bar基因的PAT試紙條，市場上銷售的多種類型的單價、二價和三價檢測試紙條均為這3種基因表達蛋白的組合，這里不做贅述。

塑料EP試管，用于將檢測樣品放在里面研碎，根據(jù)樣品量可選1.5 mL、2 mL或5 mL的，都是一次性使用耗材；塑料研磨棒，可清洗干凈后重復使用，也可用一次性筷子尖頭代替；純凈水；1支吸水用的大滴管及多支1次性使用的小滴管；放EP管的專用塑料孔板或自制泡沫孔板等。

1.2 檢測樣品取樣

1.2.1 檢測時期選擇 檢測玉米株系是否有轉基因漂移，必須在玉米開花散粉前徹底排查完成，否則造成更大范圍漂移就要被依法追究責任并受到處分。檢測最佳時期是玉米幼苗期，一般在定苗后5～7片可見葉時即可以開始自查檢測。當然也可以在播種前進行種子抽樣檢測，但干種子不容易搗碎研磨，檢測量和靈敏度都不如幼苗期，因此檢測玉米種子多適用于檢疫部門和預期目標性較強的材料，而不太適合于轉基因漂移檢測。玉米植株生長到開花前期時，葉片較老也不如幼苗期的嫩葉好操作。

1.2.2 取樣方法 取玉米幼苗任意一片葉的前端2～5 cm長，研磨用很小量葉片就夠，不需要傷害太多葉片。

育種者自檢，根據(jù)自己的材料有重點的取樣：（1）新引進系列資源是穩(wěn)定純合自交系，但不明確是否其中有轉基因材料，每份材料取一株，20～50份都可以先混合在一起進行初篩，確定沒有即可放心；（2）以上是最理想的狀態(tài)，但實際穩(wěn)定自交系材料中也可能存在轉基因的雜合體（外源單基因Aa），本世代分離有aa單株，所以只取1株是有風險的，建議每份材料隨機取3～5株進行檢測才更放心；（3）檢測對象是來源不可靠的雜交基礎群體，建議增加取樣數(shù)量，直至抽檢一半或全檢。

取好的葉片用記號筆標記編號，能與地里取樣株一一對應，分組樣葉可疊放在一起，置于塑料自封袋里保鮮（如圖1-B），取好的樣葉也可在室溫下或冰箱冷藏保存幾天再檢測。

1.3 試紙檢測方法

1.3.1 操作試驗步驟 將樣品葉片按編號順序分成若干組，一組的葉片疊在一起用剪刀剪齊一端，再剪下2 mm寬的細條形葉放入EP試管中，用研棒充分研碎，加入適量純凈水，再用研棒擠壓攪勻，保證使每片葉條的汁液都溶于水中；取出研棒，將試紙條插入綠色溶液中，溶液會迅速從試紙條底端向上虹吸，稍等片刻，就可以看到試紙條上的顯色條帶出現(xiàn)。試紙條從上往下的第一條顯色帶表示該試紙條的有效性，如果未顯色，說明試紙條已失效，需要重新更換試紙條（如圖1-C）；第二條顯色帶表示是否存在外源基因蛋白，該條帶顯色陽性（+）表示被檢樣品中有外源基因蛋白，如果第一條顯色而此條帶不顯色，則說明操作處理過程正常有效，而該樣品中不存在目標基因蛋白。

1.3.2 操作經(jīng)驗和注意事項

（1）建議每組20片葉合并在一個EP管中研磨初檢，熟練者可每組檢測達50片葉，但需要將葉條逐漸放入EP管中，以保證全部葉都被研碎。

（2）沾有葉片汁液的剪刀和塑料研棒，每次用完都要注意清洗干凈再用；如果使用木質筷子頭研磨，須將葉綠素完全洗干凈或削頭后再用于研磨下一樣品。

（3）試紙底端都標有浸入液面最深界線（如圖1-C試紙條底端的MAX線），不能超過太多，否則影響附著于試紙條上藥物試劑和抗體的作用。試紙條工作原理是利用能和外源基因表達蛋白特異結合的抗體與顯色劑結合后被固定在試紙條內[14]，葉片研磨液中的轉基因蛋白必須先與特異抗體結合，再虹吸上行與顯色劑反應方能顯示出條帶顏色。所以不能逆向吸水或間斷性虹吸，否則都會造成檢測失敗。

（4）如果一管內因為放入檢測樣葉太多，葉綠素濃度過大，往往會影響試紙條的虹吸作用，此時即使使用其他辦法將液體沾滴上來或加水稀釋也作用不大，會造成試紙條作廢。因此在插入試紙條之前必須稀釋好樣液，EP管容量不夠可更換新管進行稀釋操作。建議采取少量葉片分開研磨加水，再用一次性小滴管吸取適量合并后再插入試紙條檢測。

1.4 檢測案例

以檢測30份玉米材料為例，在田間每份材料隨機取5株的葉片，共取150片樣葉，用記號筆將材料的田間編號直接標記在葉片上，被取植株也要同樣標記上編號（此為單株取樣較麻煩）；也可以采取單行取樣，然后將行內間植株樣本合并，簡略編號寫在取樣袋上，分組裝在自封袋里帶回，按上述方法檢測。

2 結果與分析

2.1 檢測案例結果分析之一

因為是預防性轉基因漂移檢測，多數(shù)情況下會是全陰性結果，證明轉基因漂移的幾率較小。為降低試驗成本節(jié)省試紙條用量，本案例分析中采取50片葉混樣檢測的方法。首先將150片葉分成3組，為操作方便，每組研磨時先將葉片分裝在2管中（每組25片葉），稀釋溶液后再合并成1管，同時插入2種最常見的、可能被漂移的基因類型快速檢測試紙條BT和CP4，觀察到3組6個試紙條都顯示出條帶后，再用小吸管從3管中各取少量合并成1管，最后檢測PAT試紙條。結果顯示，7個試紙條都是陰性的，證明該30份材料安全，沒有發(fā)生轉基因漂移（如圖1-D）。

圖1 預防玉米轉基因漂移快速試紙條法檢測方法

2.2 檢測案例結果分析之二

以上案例最后結果，在三組之一的樣本中（EP管中包含10份材料50片樣葉）發(fā)現(xiàn)BT試紙條呈陽性反應，其余試紙條都是陰性的。取出該樣本稀釋合并前2管研磨液，分別加水稀釋溶液后再插入BT試紙條，找到其中1管為陽性的5個樣品（25片樣葉）的編號，重新取葉片研磨檢測。將樣本分成2組（3份材料15片樣葉和2份材料10片樣葉）檢測，依此類推通過排除法，找到最后1份材料5片樣葉，追溯漂移材料編號，如有必要可追溯到陽性單株。試驗過程和結果如圖2表示。

圖2 試紙條法檢測田間轉基因漂移株系典型案例分析流程圖

此操作流程從10份玉米材料中檢測到1份轉單抗基因（BT抗蟲蛋白）漂移，不記檢測到單株所耗試紙條數(shù)量，共使用9個試紙條，是該1/2排除法檢測耗費試紙條最大用量，最小用量是7個。

其他排除法組合設計也可以采用，原則是樣品全部被檢測確認，并盡可能節(jié)約試紙條。

最后5個單株檢測，因為估計陽性率高，采用分組法反而用試紙條數(shù)更多。采用逐株檢測，結果4陽1陰，證明該株系是雜合狀態(tài)(Aa)的轉基因材料；如果5株都是陽性，則證明該系已經(jīng)是穩(wěn)定的純合系(AA)轉基因材料；如果僅1株檢到陽性其余都是陰性的，證明可能是外源花粉或種子混雜造成的轉基因漂移。

實際檢測中，還會遇到其他多種情況，需要育種者對自己的材料來源比較了解，取樣檢測就更有目標性。這里只介紹2種典型情況以作示范。

3 討論與結論

玉米預防轉基因漂移檢測是廣大常規(guī)育種人迫切需求的。選育一個好的玉米品種，從組建基礎群體材料開始到參加區(qū)試，至少需要5～8年，如果在選系前不慎被非預期的一?；ǚ垭s交造成轉基因漂移，在不知情的狀況下辛苦選育多代后，參加區(qū)試轉基因檢測呈陽性，辛苦幾年的材料便失去了價值。玉米花粉量多且輕，轉基因玉米花粉傳播是轉基因在空間逃逸的主要途徑[15-16]。中國已于2020年6月開始陸續(xù)為一些轉基因作物（包括棉花、玉米和大豆）頒發(fā)了安全證書，預計在不遠的將來，將會有更多的轉基因作物品種在一定范圍內被批準進行商業(yè)化種植。因而這種預防性檢測技術將會有更加廣泛的應用。

有關轉基因快速試紙條的靈敏性，筆者根據(jù)個人實踐經(jīng)驗，最高可達1/50的陽性檢出結果，但此時顯色帶顏色較淡，顯色時間也需要較長。在檢測案例結果分析之一中，最后使用的PAT試紙條實際大約是1/30的靈敏度，并不是1/150，因為取樣每份是5片葉，即試驗已包括重復數(shù)，結果更可靠。但如果采取此方案檢測的是雜交群體，或每份被檢材料只取1株樣葉的情況，則無法保證檢測的準確性。

目前，每種類試紙條只能檢測一種類型的外源基因，而其他轉基因類型是很多的[17-19]，并沒有相對應的試紙條研發(fā)生產(chǎn)出來。因此采用快速試紙條法檢測是否存在轉基因漂移的漏洞很大，僅僅起到玉米育種者的自我篩查初檢作用，真正鑒別是否有轉基因還是需要專業(yè)檢疫部門的DNA分子檢測等技術[20-21]才能準確鑒定。

本研究是根據(jù)筆者10余年來開展轉基因材料選育的經(jīng)驗總結而來，具有很強的實用性。本方法的操作步驟簡便易學，非常適合專業(yè)和非專業(yè)育種者或檢測人員對田間材料在自查或檢驗中使用。熟練掌握這一試紙條快速檢測法，能有效篩查和預防由于花粉或種子非預期混雜造成的轉基因漂移。本方法或經(jīng)略微改良的類似方法，也可用于在其他植物中檢測由花粉或種子非預期混雜造成的轉基因漂移。