崔貴梅，李小波，馬 樾，郝曜山，張歡歡，孫 毅

（1山西大豐種業(yè)有限公司，太原 030031；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030031）

0 引言

轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化在中國尚未開放，只允許在批準(zhǔn)的范圍內(nèi)和可控條件下開展轉(zhuǎn)基因玉米試驗(yàn)研究。隨著國際和國內(nèi)轉(zhuǎn)基因玉米研究的快速發(fā)展，國內(nèi)非法種植轉(zhuǎn)基因玉米的現(xiàn)象層出不窮[1]，國內(nèi)農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門對農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因?qū)嵤┍O(jiān)管的力度也在加大。加強(qiáng)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因檢測和執(zhí)法力度，防止轉(zhuǎn)基因漂移對于保護(hù)中國生物技術(shù)育種的健康發(fā)展、生物多樣性和農(nóng)業(yè)生態(tài)安全都是至關(guān)重要的。

由于玉米屬于高異交受粉作物，花粉的擴(kuò)散距離受玉米揚(yáng)花期的氣象和地理條件影響，不同地方研究得出的結(jié)果差別較大[2-6]，借助風(fēng)力及大氣湍流玉米花粉傳播距離可達(dá)800～1000 m以上[7-8]，常規(guī)玉米被非預(yù)期轉(zhuǎn)基因漂移影響的可能性較大。歐洲2001—2010年期間在包括德國、瑞士和比利時在內(nèi)的多個歐洲國家的216個地點(diǎn)進(jìn)行的一系列大規(guī)模試驗(yàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[9]，花粉來源最遠(yuǎn)的距離為4.45 km。在該研究中他們建議，在德國勃蘭登堡州將Bt轉(zhuǎn)基因玉米種植的緩沖帶從100 m（2007年）擴(kuò)大到800～1000 m。在中國，目前農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管制度規(guī)定轉(zhuǎn)基因玉米隔離距離為300 m[10]。此外，異地材料資源共享，在常規(guī)玉米選育工作者之間交流頻率也較高，未知因素造成轉(zhuǎn)基因種子非預(yù)期擴(kuò)散的可能性時有發(fā)生。因此，對非預(yù)期轉(zhuǎn)基因漂移的檢測十分重要。除了各地農(nóng)業(yè)農(nóng)村局科教處等專職檢查部門抽查檢測外，育種者自查自檢是預(yù)防此問題發(fā)生的主要途徑。

海南省南部的三亞、樂東、陵水三市縣及周邊地區(qū)，已經(jīng)成為中國重要的育種基地。鑒于南繁的特殊性，這一地區(qū)在冬季育種單位集中，轉(zhuǎn)基因漂移潛在風(fēng)險高于全國其他地區(qū)，因而轉(zhuǎn)基因生物安全在南繁地區(qū)備受關(guān)注[11-12]。使用轉(zhuǎn)基因蛋白免疫層析快速檢測試紙條，是目前最簡便又行之有效的方法。按照適當(dāng)?shù)牟蓸硬襟E，試紙條可以在給定的一批樣品中以99%的置信水平檢測出少于0.15%的轉(zhuǎn)基因成分[13]。本研究從常規(guī)玉米育種者自查角度，根據(jù)多年實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)玉米轉(zhuǎn)基因快速檢測試紙條使用的具體方法和操作步驟，希望能為廣大玉米育種工作者提供參考。

1 材料和方法

1.1 檢測試驗(yàn)用品

購買轉(zhuǎn)基因快速檢測試紙條，分為檢測多種基因類型的試紙條，國內(nèi)目前常用的主要有3種（如圖1-A）：分別是檢測轉(zhuǎn)抗蟲基因BtCryⅠAb/Ac、檢測轉(zhuǎn)抗除草劑草甘膦Cp4 EPSPS基因和檢測抗除草劑草銨膦Bar基因的PAT試紙條，市場上銷售的多種類型的單價、二價和三價檢測試紙條均為這3種基因表達(dá)蛋白的組合，這里不做贅述。

塑料EP試管，用于將檢測樣品放在里面研碎，根據(jù)樣品量可選1.5 mL、2 mL或5 mL的，都是一次性使用耗材；塑料研磨棒，可清洗干凈后重復(fù)使用，也可用一次性筷子尖頭代替；純凈水；1支吸水用的大滴管及多支1次性使用的小滴管；放EP管的專用塑料孔板或自制泡沫孔板等。

1.2 檢測樣品取樣

1.2.1 檢測時期選擇 檢測玉米株系是否有轉(zhuǎn)基因漂移，必須在玉米開花散粉前徹底排查完成，否則造成更大范圍漂移就要被依法追究責(zé)任并受到處分。檢測最佳時期是玉米幼苗期，一般在定苗后5～7片可見葉時即可以開始自查檢測。當(dāng)然也可以在播種前進(jìn)行種子抽樣檢測，但干種子不容易搗碎研磨，檢測量和靈敏度都不如幼苗期，因此檢測玉米種子多適用于檢疫部門和預(yù)期目標(biāo)性較強(qiáng)的材料，而不太適合于轉(zhuǎn)基因漂移檢測。玉米植株生長到開花前期時，葉片較老也不如幼苗期的嫩葉好操作。

1.2.2 取樣方法 取玉米幼苗任意一片葉的前端2～5 cm長，研磨用很小量葉片就夠，不需要傷害太多葉片。

育種者自檢，根據(jù)自己的材料有重點(diǎn)的取樣：（1）新引進(jìn)系列資源是穩(wěn)定純合自交系，但不明確是否其中有轉(zhuǎn)基因材料，每份材料取一株，20～50份都可以先混合在一起進(jìn)行初篩，確定沒有即可放心；（2）以上是最理想的狀態(tài)，但實(shí)際穩(wěn)定自交系材料中也可能存在轉(zhuǎn)基因的雜合體（外源單基因Aa），本世代分離有aa單株，所以只取1株是有風(fēng)險的，建議每份材料隨機(jī)取3～5株進(jìn)行檢測才更放心；（3）檢測對象是來源不可靠的雜交基礎(chǔ)群體，建議增加取樣數(shù)量，直至抽檢一半或全檢。

取好的葉片用記號筆標(biāo)記編號，能與地里取樣株一一對應(yīng)，分組樣葉可疊放在一起，置于塑料自封袋里保鮮（如圖1-B），取好的樣葉也可在室溫下或冰箱冷藏保存幾天再檢測。

1.3 試紙檢測方法

1.3.1 操作試驗(yàn)步驟 將樣品葉片按編號順序分成若干組，一組的葉片疊在一起用剪刀剪齊一端，再剪下2 mm寬的細(xì)條形葉放入EP試管中，用研棒充分研碎，加入適量純凈水，再用研棒擠壓攪勻，保證使每片葉條的汁液都溶于水中；取出研棒，將試紙條插入綠色溶液中，溶液會迅速從試紙條底端向上虹吸，稍等片刻，就可以看到試紙條上的顯色條帶出現(xiàn)。試紙條從上往下的第一條顯色帶表示該試紙條的有效性，如果未顯色，說明試紙條已失效，需要重新更換試紙條（如圖1-C）；第二條顯色帶表示是否存在外源基因蛋白，該條帶顯色陽性（+）表示被檢樣品中有外源基因蛋白，如果第一條顯色而此條帶不顯色，則說明操作處理過程正常有效，而該樣品中不存在目標(biāo)基因蛋白。

1.3.2 操作經(jīng)驗(yàn)和注意事項

（1）建議每組20片葉合并在一個EP管中研磨初檢，熟練者可每組檢測達(dá)50片葉，但需要將葉條逐漸放入EP管中，以保證全部葉都被研碎。

（2）沾有葉片汁液的剪刀和塑料研棒，每次用完都要注意清洗干凈再用；如果使用木質(zhì)筷子頭研磨，須將葉綠素完全洗干凈或削頭后再用于研磨下一樣品。

（3）試紙底端都標(biāo)有浸入液面最深界線（如圖1-C試紙條底端的MAX線），不能超過太多，否則影響附著于試紙條上藥物試劑和抗體的作用。試紙條工作原理是利用能和外源基因表達(dá)蛋白特異結(jié)合的抗體與顯色劑結(jié)合后被固定在試紙條內(nèi)[14]，葉片研磨液中的轉(zhuǎn)基因蛋白必須先與特異抗體結(jié)合，再虹吸上行與顯色劑反應(yīng)方能顯示出條帶顏色。所以不能逆向吸水或間斷性虹吸，否則都會造成檢測失敗。

（4）如果一管內(nèi)因?yàn)榉湃霗z測樣葉太多，葉綠素濃度過大，往往會影響試紙條的虹吸作用，此時即使使用其他辦法將液體沾滴上來或加水稀釋也作用不大，會造成試紙條作廢。因此在插入試紙條之前必須稀釋好樣液，EP管容量不夠可更換新管進(jìn)行稀釋操作。建議采取少量葉片分開研磨加水，再用一次性小滴管吸取適量合并后再插入試紙條檢測。

1.4 檢測案例

以檢測30份玉米材料為例，在田間每份材料隨機(jī)取5株的葉片，共取150片樣葉，用記號筆將材料的田間編號直接標(biāo)記在葉片上，被取植株也要同樣標(biāo)記上編號（此為單株取樣較麻煩）；也可以采取單行取樣，然后將行內(nèi)間植株樣本合并，簡略編號寫在取樣袋上，分組裝在自封袋里帶回，按上述方法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測案例結(jié)果分析之一

因?yàn)槭穷A(yù)防性轉(zhuǎn)基因漂移檢測，多數(shù)情況下會是全陰性結(jié)果，證明轉(zhuǎn)基因漂移的幾率較小。為降低試驗(yàn)成本節(jié)省試紙條用量，本案例分析中采取50片葉混樣檢測的方法。首先將150片葉分成3組，為操作方便，每組研磨時先將葉片分裝在2管中（每組25片葉），稀釋溶液后再合并成1管，同時插入2種最常見的、可能被漂移的基因類型快速檢測試紙條BT和CP4，觀察到3組6個試紙條都顯示出條帶后，再用小吸管從3管中各取少量合并成1管，最后檢測PAT試紙條。結(jié)果顯示，7個試紙條都是陰性的，證明該30份材料安全，沒有發(fā)生轉(zhuǎn)基因漂移（如圖1-D）。

圖1 預(yù)防玉米轉(zhuǎn)基因漂移快速試紙條法檢測方法

2.2 檢測案例結(jié)果分析之二

以上案例最后結(jié)果，在三組之一的樣本中（EP管中包含10份材料50片樣葉）發(fā)現(xiàn)BT試紙條呈陽性反應(yīng)，其余試紙條都是陰性的。取出該樣本稀釋合并前2管研磨液，分別加水稀釋溶液后再插入BT試紙條，找到其中1管為陽性的5個樣品（25片樣葉）的編號，重新取葉片研磨檢測。將樣本分成2組（3份材料15片樣葉和2份材料10片樣葉）檢測，依此類推通過排除法，找到最后1份材料5片樣葉，追溯漂移材料編號，如有必要可追溯到陽性單株。試驗(yàn)過程和結(jié)果如圖2表示。

圖2 試紙條法檢測田間轉(zhuǎn)基因漂移株系典型案例分析流程圖

此操作流程從10份玉米材料中檢測到1份轉(zhuǎn)單抗基因（BT抗蟲蛋白）漂移，不記檢測到單株所耗試紙條數(shù)量，共使用9個試紙條，是該1/2排除法檢測耗費(fèi)試紙條最大用量，最小用量是7個。

其他排除法組合設(shè)計也可以采用，原則是樣品全部被檢測確認(rèn)，并盡可能節(jié)約試紙條。

最后5個單株檢測，因?yàn)楣烙嬯栃月矢?，采用分組法反而用試紙條數(shù)更多。采用逐株檢測，結(jié)果4陽1陰，證明該株系是雜合狀態(tài)(Aa)的轉(zhuǎn)基因材料；如果5株都是陽性，則證明該系已經(jīng)是穩(wěn)定的純合系(AA)轉(zhuǎn)基因材料；如果僅1株檢到陽性其余都是陰性的，證明可能是外源花粉或種子混雜造成的轉(zhuǎn)基因漂移。

實(shí)際檢測中，還會遇到其他多種情況，需要育種者對自己的材料來源比較了解，取樣檢測就更有目標(biāo)性。這里只介紹2種典型情況以作示范。

3 討論與結(jié)論

玉米預(yù)防轉(zhuǎn)基因漂移檢測是廣大常規(guī)育種人迫切需求的。選育一個好的玉米品種，從組建基礎(chǔ)群體材料開始到參加區(qū)試，至少需要5～8年，如果在選系前不慎被非預(yù)期的一?；ǚ垭s交造成轉(zhuǎn)基因漂移，在不知情的狀況下辛苦選育多代后，參加區(qū)試轉(zhuǎn)基因檢測呈陽性，辛苦幾年的材料便失去了價值。玉米花粉量多且輕，轉(zhuǎn)基因玉米花粉傳播是轉(zhuǎn)基因在空間逃逸的主要途徑[15-16]。中國已于2020年6月開始陸續(xù)為一些轉(zhuǎn)基因作物（包括棉花、玉米和大豆）頒發(fā)了安全證書，預(yù)計在不遠(yuǎn)的將來，將會有更多的轉(zhuǎn)基因作物品種在一定范圍內(nèi)被批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化種植。因而這種預(yù)防性檢測技術(shù)將會有更加廣泛的應(yīng)用。

有關(guān)轉(zhuǎn)基因快速試紙條的靈敏性，筆者根據(jù)個人實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，最高可達(dá)1/50的陽性檢出結(jié)果，但此時顯色帶顏色較淡，顯色時間也需要較長。在檢測案例結(jié)果分析之一中，最后使用的PAT試紙條實(shí)際大約是1/30的靈敏度，并不是1/150，因?yàn)槿用糠菔?片葉，即試驗(yàn)已包括重復(fù)數(shù)，結(jié)果更可靠。但如果采取此方案檢測的是雜交群體，或每份被檢材料只取1株樣葉的情況，則無法保證檢測的準(zhǔn)確性。

目前，每種類試紙條只能檢測一種類型的外源基因，而其他轉(zhuǎn)基因類型是很多的[17-19]，并沒有相對應(yīng)的試紙條研發(fā)生產(chǎn)出來。因此采用快速試紙條法檢測是否存在轉(zhuǎn)基因漂移的漏洞很大，僅僅起到玉米育種者的自我篩查初檢作用，真正鑒別是否有轉(zhuǎn)基因還是需要專業(yè)檢疫部門的DNA分子檢測等技術(shù)[20-21]才能準(zhǔn)確鑒定。

本研究是根據(jù)筆者10余年來開展轉(zhuǎn)基因材料選育的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。本方法的操作步驟簡便易學(xué)，非常適合專業(yè)和非專業(yè)育種者或檢測人員對田間材料在自查或檢驗(yàn)中使用。熟練掌握這一試紙條快速檢測法，能有效篩查和預(yù)防由于花粉或種子非預(yù)期混雜造成的轉(zhuǎn)基因漂移。本方法或經(jīng)略微改良的類似方法，也可用于在其他植物中檢測由花粉或種子非預(yù)期混雜造成的轉(zhuǎn)基因漂移。