馬杰，丁野，孫輝*，王湘波（1. 湖南省藥品檢驗研究院，長沙 410001；2. 湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)中心，長沙 410001）

黃精是百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricumRed.或多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua 的干燥根莖，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效[1]，是藥食同源的多用途植物，為我國常用大宗中藥材品種。隨著國內(nèi)外對黃精開發(fā)的熱度不斷升溫，特別是在營養(yǎng)保健、中國老年疾病預(yù)防等方面的需求增大，黃精的種植規(guī)模不斷擴大。在黃精的各種來源中，尤以湖南產(chǎn)的多花黃精品質(zhì)為上乘[2-3]。為了防治病蟲害[4-5]，黃精藥材種植者往往憑借經(jīng)驗用藥，種植過程中亂用、濫用、誤用農(nóng)藥時有發(fā)生，導(dǎo)致質(zhì)量安全隱患，從而制約了黃精產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和升級。目前，黃精中的農(nóng)藥多殘留檢測報道較少，缺乏較為系統(tǒng)、可靠的檢測方法。

QuEChERS 法是近年來中成藥中農(nóng)藥多殘留成分較為常用的前處理方法之一[6-7]，具有快速（Quick）、簡單（Easy）、廉價（Cheap）、有效（Effective）、可靠（Rugged）及安全（Safe）的優(yōu)勢，其利用吸附劑填料與樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用達到對供試品除雜凈化的目的，以實現(xiàn)雜質(zhì)的最低限度干擾。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS/MS）技術(shù)靈敏度高、專屬性強，可一次完成對多種農(nóng)藥殘留的痕量分析，目前已被廣泛應(yīng)用于中藥材中農(nóng)藥多殘留的測定。QuEChERS 聯(lián)合GC-MS/MS，成功解決了各種復(fù)雜基質(zhì)中藥材中多種農(nóng)藥殘留的檢測問題[8-9]。

為實現(xiàn)對黃精藥材中農(nóng)藥殘留風(fēng)險評價，本文建立了一種QuEChERS-GC-MS/MS 同時測定藥材中74 種農(nóng)藥殘留量的方法，并測定了湖南省內(nèi)收集的4 批次黃精樣品中的農(nóng)藥殘留情況。

1 儀器與試藥

7890B/7010 型三重四級桿氣相色譜質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；AE240 型天平（德國梅特勒托利多公司）；EYELA CM-1000 高速震蕩儀（上海愛朗儀器有限公司）。

乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；SHIMSEN樣品前處理凈化鹽包（含無水硫酸鎂6.0 g 與無水乙酸鈉1.5 g），SHIMSEN 樣品前處理凈化材料[含無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化炭黑90 mg，日本島津公司]；冰醋酸為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水均為高純水（經(jīng)Milli-Q 超純水器純化）；74 種農(nóng)藥對照品溶液（批號：30765XT/30766XT/30767XT，質(zhì)量濃度均為100 μg·mL－1，北京曼哈格生物科技有限公司）；氘代莠去津內(nèi)標儲備液（ethylamino D5，批號：20441XB，100 μg·mL－1）。4 批樣品購自藥材市場及中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)，產(chǎn)地均為湖南，經(jīng)丁野主任中藥師鑒定為黃精Polygonatum sibiricum Red.或多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua 的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[10-12]

HP-5MS 彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣，恒壓模式，柱前壓為124 kPa；進樣口溫度為280℃，脈沖不分流進樣。程序升溫：初始溫度70℃，保持2 min，先以25 ℃·min－1升溫至140℃，再以4℃·min－1升溫至200 ℃，最后以7 ℃·min－1升溫至280℃，保持8 min。

2.2 質(zhì)譜條件

EI 源，70 eV，離子源溫度為270℃，接口溫度為280℃。碰撞氣：氮氣（純度≥99.999%）；溶劑延遲：5 min；質(zhì)譜監(jiān)測模式：MRM 模式分段；每種化合物選擇兩對離子對。保留時間、離子對、碰撞能等如表1 所示。

表1 74 種農(nóng)藥的保留時間、監(jiān)測離子對、碰撞電壓(CE)Tab 1 Retention time，monitoring ion pairs and collision voltage of the 74 pesticides

續(xù)表1

2.3 溶液的配制

2.3.1 供試品溶液 將樣品置于－18℃冷凍48 h后，立即粉碎得黃精粉末。取黃精粉末（過二號篩）3 g，精密稱定，置于50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，加入超純水15 min，渦旋使充分浸潤，靜置30 min；精密加入1%醋酸乙腈（取冰醋酸溶液1 mL，加乙腈至1000 mL）15 mL 和內(nèi)標溶液100 μL，渦旋震蕩5 min，冰浴冷卻5 min，加入前處理凈化鹽包（含無水硫酸鎂6.0 g 與無水乙酸鈉1.5 g），渦旋混合5 min，離心5 min（8000 r·min－1）；取上清液9 mL 置于含SHIMSEN 樣品前處理凈化材料的塑料離心管中，渦旋混合1 min，離心，精密吸取上清液5 mL 置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取對照品溶液，加含0.05%醋酸的乙腈配制成0.1 μg·mL－1和1 μg·mL－1的兩種混合對照品溶液。

2.3.3 內(nèi)標溶液的制備 取氘代莠去津內(nèi)標儲備液適量，加乙腈制成質(zhì)量濃度為6 μg·mL－1的溶液。

2.3.4 空白基質(zhì)的篩選 取黃精樣品，按照“2.3.1”項下方法制備，進樣分析，找出未檢出74 種目標農(nóng)藥的空白基質(zhì)樣品，最終確認樣品4為空白基質(zhì)樣品。

2.3.5 基質(zhì)混合對照品溶液的制備 取空白樣品3 g，共6 份，同“2.3.1”項下方法處理至“置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL”，分別加入混合對照品溶液（0.1 μg·mL－1）50、100 μL，混合對照品溶液（1 μg·mL－1）50、100、200、400 μL，加乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得基質(zhì)混合對照品溶液，系列質(zhì)量濃度分別為5、10、50、100、200、400 ng·mL－1。

精密吸取上述溶液各1 μL，進樣測定，按標準曲線法計算供試品中74 種農(nóng)藥殘留量?；|(zhì)混合對照品溶液、檢出樣品溶液總離子流圖見圖1，檢出農(nóng)藥的MRM 檢測結(jié)果質(zhì)譜圖見圖2。

圖1 總離子流圖Fig 1 TIC of 74 pesticides

圖2 3 種檢出農(nóng)藥的MRM 檢測結(jié)果質(zhì)譜圖Fig 2 Typical mass chromatograms of MRM monitoring results of 3 pesticides

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性關(guān)系 精密吸取系列混合對照品溶液各1 μL，進樣測定，記錄各待測組分的色譜峰面積，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、各成分峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標（Y），進行回歸分析，結(jié)果表明，各農(nóng)藥對照品線性關(guān)系良好，見表2。

2.4.2 精密度試驗 取“2.3.5”項下質(zhì)量濃度為100 ng·mL－1的對照品溶液，分別精密吸取1 μL，進樣測定6 次，計算各農(nóng)藥對照品峰面積的RSD，結(jié)果均小于15%（n＝6），表明儀器的精密度滿足試驗要求。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一黃精樣品（1 號），共6 份，制成供試品后測定，樣品檢出殺蟲脒、苯氟磺胺和腐霉利，故以樣品中的殺蟲脒、苯氟磺胺和腐霉利的峰面積計算含量后求得RSD，結(jié)果三者的RSD分別為6.3%、4.3%和5.9%，均小于15%，符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。

2.4.4 加樣回收試驗 取空白樣品3 g，共9 份，分別精密加入混合對照品溶液（0.1 μg·mL－1）50、100、500 μL，每個濃度各重復(fù)3 份，同供試品溶液的制備方法處理，即得加樣回收對照品溶液。按“2.1”項下色譜質(zhì)譜條件測定并計算回收率，結(jié)果平均回收率均在60%～140%的農(nóng)藥數(shù)占比為94.6%，RSD均小于15%，結(jié)果見表2。

2.4.5 檢測限（LOD）與定量限（LOQ） 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部“藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則”中信噪比法計算檢測限與定量限，以上述線性關(guān)系考察中質(zhì)量濃度為5 ng·mL－1的各目標農(nóng)藥的信噪比。按3 倍信噪比對應(yīng)的目標物濃度作為檢測限，以10 倍信噪比對應(yīng)的目標物濃度作為定量限，結(jié)果見表2。

表2 相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限、定量限和加樣回收率Tab 2 Correlation coefficient，Linear range，LOD，LOQ and recovery

續(xù)表2

2.5 樣品測定

按建立的方法處理并測定4 批收集的樣品，結(jié)果見表3，樣品中檢出農(nóng)藥品種為殺蟲脒、苯氟磺胺和腐霉利，其余農(nóng)藥均未檢出。

表3 黃精農(nóng)藥殘留測定結(jié)果(μg·kg－1)Tab 3 Determination of pesticide residues in 4 batches of Rhizoma Polygonati (μg·kg－1)

3 討論

本文首次將 QuEChERS 前處理方法結(jié)合 GCMS/MS 檢測技術(shù)用于黃精藥材中多種農(nóng)藥殘留的快速分析檢測。

經(jīng)前期調(diào)研，黃精以林下套種、杉樹林下種植和大田種植等為主要生產(chǎn)模式，由于是多年生植物，使用農(nóng)藥消滅病蟲害是保證黃精產(chǎn)量的重要方法之一，并且由于歷史原因耕地土壤中有機氯類、有機磷類等農(nóng)藥品種會有較大殘留，因此，本研究選擇包含有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類在內(nèi)的74 種農(nóng)藥品種作為對照較為全面。

對黃精飲片的前處理條件進行了三個方面的摸索，包括乙腈高速勻漿直接提取、直接提?。玃SA 固相萃取小柱凈化和QuEChERS 法，結(jié)果QuEChERS 法能夠較好地除去黃精樣品中的多糖、色素等不利于農(nóng)藥測定的干擾雜質(zhì)，降低了因污染對分析儀器穩(wěn)定性的影響。黃精中含多糖成分較多，在粉碎和樣品前處理過程中容易粘連結(jié)塊，本試驗在使黃精樣品得到充分冷凍后再立即粉碎，在加入QuEChERS 前處理鹽包之前冰浴冷卻溶液，并在其后的步驟中控制好溶液溫度，避免了粉碎和前處理樣品過程中的結(jié)塊現(xiàn)象。采用藥典通則2341 項下推薦的質(zhì)譜參數(shù)，部分農(nóng)藥品種的響應(yīng)偏低，因此本研究對監(jiān)測離子對、碰撞電壓分別進行了優(yōu)化。

本法74 種農(nóng)藥殘留在4 ～400 ng·mL－1內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限和定量限分別在0.04 ～3.32 和0.14 ～11.05 mg·kg－1，3 個不同濃度添加水平的平均回收率在60%～120%的農(nóng)藥數(shù)占比為94.6%，RSD均小于15%，適用于不同基原的湘產(chǎn)黃精（黃精和多花黃精）的74 種農(nóng)藥殘留檢測，對湘產(chǎn)黃精生產(chǎn)種植中農(nóng)藥監(jiān)控有一定意義。由于本次試驗僅收集4 批次的樣本，代表性不足，并不能完全反映湖南產(chǎn)黃精的農(nóng)藥污染真實情況。為實現(xiàn)湘產(chǎn)黃精的整體農(nóng)殘監(jiān)控及用藥安全的全面了解，可通過對產(chǎn)地農(nóng)藥使用習(xí)慣、土壤污染狀況開展實地調(diào)研、收集更多產(chǎn)地的樣品后，應(yīng)用本研究建立的方法進行測定并進行風(fēng)險評估。