周莉莉,張霞,彭巧珍,謝宇璐,葉喜德*,金鐳*(. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院藥劑科,合肥 00;. 江西中醫(yī)藥大學藥學院,南昌 0004;. 南昌航空大學信息工程學院,南昌 006)
天麻為蘭科無綠葉并寄生草本植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖[1]。性甘、味平,入肝經(jīng)。具熄風止痙、祛風之痛之效,為治偏頭痛之要藥。始載于《神農本草經(jīng)》并列之為上品[2]。天麻主含酚類、多糖、有機酸類、甾醇類、氨基酸及多種微量元素等成分[3]。
天麻炮制方法較多,如煨法、酒炙、蜜麩炒等,但未見炮制機制的研究。天麻姜制始載于《幼幼集成》[4],后為江西“建昌幫”列為其特色飲片之一[5]。目前江西、廣東、福建等各地方炮制規(guī)范均收錄了姜天麻[6-8],但均未見其炮制機制的研究?!敖ú龓汀闭J為姜制天麻可增強其祛痰熄風,定眩止痛之功。研究表明,天麻經(jīng)姜制后,其化學成分發(fā)生了變化,而且動物行為學試驗表明該炮制利于天麻對大鼠腦組織的保護[9-10],且姜天麻對硝酸甘油誘導的大鼠偏頭痛抑制作用強于《中國藥典》收錄的天麻炮制品[11-12]。顯然,天麻經(jīng)姜制后藥效增強,與其發(fā)生的有效成分變化有關。但如何使這些成分充分溶出,仍缺乏最佳提取工藝。基于前期炮制品制備探討的姜天麻炮制工藝[13],本研究采用UPLC 定量分析,以天麻素,天麻苷元,對羥基苯甲酸,巴利森苷A、B、C、E 等多指標為質量評價方法,并結合響應曲面法[14]對料液比、提取溫度及提取溶劑之間的交互作用進行考察,優(yōu)選出姜天麻最佳提取工藝參數(shù),提高該炮制品中有效成分得率,為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支撐。
Waters Acquity(e2695)超高效液相色譜儀(新加坡Waters 公司);TGL-16B 高速離心機(上海安亭科學儀器廠);AR240 十萬分之一電子天平(Mettler Toledo 公司);KQ-500E 超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。
天麻素(批號:CHB190212)、 天麻苷原(CHB190214)、 對羥基苯甲醇(批號:CHB180226)、巴利森苷A(批號:CHB180222)、巴利森苷B(批號:CHB180223)、巴利森苷C(批號:CHB180224)、 巴利森苷E(批號:CHB180225)(對照品,質量分數(shù)≥98%,成都克洛瑪生物科技有限公司);水為超純水,乙腈、甲醇為色譜純,磷酸為分析純。
天麻、生姜于(代富安蟲草參茸行,批號:20200173),經(jīng)江西中醫(yī)藥大學龔千鋒教授鑒定分別為蘭科天麻(Gastrodia elataBlume.)干燥塊莖、植物姜(Zingiber officinaleRose.)的新鮮根莖。
色譜柱為Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),體積流量0.2 mL·min-1,柱溫35℃。流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脫:0 ~14 min,3%~29%A;檢測波長為220 nm。理論塔板數(shù)按天麻素峰計算不低于5000。
精密稱取天麻素0.002 58 g、天麻苷元0.004 96 g、對羥基苯甲酸0.002 48 g、巴利森苷A0.002 54 g、巴利森苷B 0.004 97 g、巴利森苷C 0.002 37 g、巴利森苷E 0.002 22 g,用水溶液(乙腈-水=3∶97)定容于5 mL 量瓶中。
2.3.1 姜天麻制備[13]按“建昌幫”炮制規(guī)范炮制,打粉過3 號篩,備用。
2.3.2 供試品制備 精密稱取姜天麻粉末1.00 g,置50 mL 錐形瓶中,加入20 mL 70%乙醇溶液,搖勻,靜置30 min,稱定重量,30℃超聲30 min,放冷,再稱定重量,用70%乙醇溶液補足減失量,過濾,取續(xù)濾液10 mL,揮去溶液,用水溶液(乙腈-水=3∶97)溶解,定容置25 mL 量瓶。取溶液適量,離心(15 000 r·min-1、10 min),0.22 μm濾膜過濾,即得供試品溶液。
2.3.3 混合對照品的制備 吸取“2.2”項下各對照品天麻素200 μL、天麻苷元10 μL、對羥基苯甲酸20 μL、巴利森苷A 200 μL、巴利森苷B 200 μL、巴利森苷C 150 μL、巴利森苷E 250 μL 加入2 mL EP 管,高速離心后,過0.22 μm 濾膜,即得混合對照品。
分別精密吸取混合對照品、供試品溶液各2 μL,注入液相色譜儀測定。天麻素,天麻苷元,對羥基苯甲酸,巴利森苷A、B、C、E 的保留時間分別為2.91、4.74、6.81、7.07、11.46、9.39、10.03 min?;旌蠈φ掌放c供試品各成分分離度良好,見圖1。
圖1 天麻對照品(A)和供試品溶液(B)Fig 1 Gastrodia elata reference substance(A)and test solution(B)
2.4.1 線性關系考察 吸取“2.3.3”項下混合對照品溶液,逐級稀釋并進樣測定,結果見表1。
表1 各成分線性關系考察結果Tab 1 Linearity of each component
2.4.2 精密度考察 取混合對照品重復進樣6 次,進行精密度試驗。天麻素、天麻苷元和對羥基苯甲酸的峰面積RSD分別為0.68%、1.1%、1.3%;巴利森苷A、B、C、E 的峰面積RSD分別為0.19%、0.22%、0.46%、0.37%。
2.4.3 穩(wěn)定性考察 于1、4、8、12、16、24 h測定同一份供試品溶液(7 號樣品)的穩(wěn)定性,得天麻素、天麻苷元和對羥基苯甲酸的峰面積RSD分別為0.27%、2.82%、3.0%;巴利森苷A、B、C、E 的峰面積RSD分別為1.3%、0.57%、2.1%、0.37%。
2.4.4 重復性考察 精密稱取同一炮制方法下姜天麻粉末1.00 g,依“2.3.2”項下方法(7 號樣品)制備,分別平行制備6 份。分別進樣2 μL,測定峰面積,得天麻素、天麻苷元和對羥基苯甲酸的峰面積RSD分別為2.8%、2.0%、2.8%;巴利森苷A、B、C、E 的峰面積RSD分別為2.4%、2.8%、1.4%、1.5%。
2.4.5 加樣回收考察 精密量取已測定的供試品溶液 3 份,每份1 mL,分別按供試品的80%、100%、120%加入混合對照品溶液(天麻素0.100 mg·mL-1,天麻苷元0.010 mg·mL-1,對羥基苯甲酸0.010 mg·mL,巴利森苷A、B、C、E分別為0.099、0.193、0.059、0.108 mg·mL-1)每個平行3 份,進樣測定各指標含量,測得天麻素、天麻苷元和對羥基苯甲酸平均回收率(RSD)分別為103.12%(1.8%)、98.67%(2.8%)、100.34%(1.8%)。巴利森苷A、B、C、E 平均回收率(RSD)分別為101.56%(3.0%)、104.65%(1.8%)、99.13%(2.4%)、102.43%(2.5%)。
由于天麻中巴利森苷類成分具有熱不穩(wěn)定性[15]。因此,選擇適宜的提取溶媒、提取時間和提取溫度是提高該類成分得率的主要因素。本研究選擇提取溶媒、提取時間、超聲溫度、提取時間、料液比、粒徑條件進行考察。
稱取姜天麻粉末1.0000 g 5 份,固定其他條件不變,分別考察不同提取溶劑(水和不同濃度乙醇)、超聲溫度(20、30、40、50、60 ℃)、提取時間(20、30、40、50、60 min)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)、 粒徑(過10、24、50、60、80 目篩)對提取效率的影響,結果如圖2 所示。
圖2 不同提取條件對提取效率的影響Fig 2 Effect of different extraction conditions on extraction efficiency
2.6.1 試驗設計 根據(jù)“2.5”項下單因素試驗考察結果,設計因素水平見表2。
表2 響應面因素及水平Tab 2 Factor and level of response surface
2.6.2 試驗結果 通過天麻目前研究進展及藥理作用權重分配,確定綜合評分(Z)=天麻素×30% +天麻苷元×20% +對羥基苯甲酸×10%+巴利森苷A×10%+巴利森苷B×10%+巴利森苷C×10%+巴利森苷E×10%。設計3 因素3 水平試驗設計方案,應用Design-Expert V8.0.6 軟件,中心組合設計Box-Behnken 分析處理,得到3 因素3 水平共17 組試驗。試驗方案分析及結果見表3。
表3 響應面設計方案及試驗結果Tab 3 Response surface design
2.6.3 響應面分析 響應曲面3D 圖(見圖3)分析可得,傾斜度越高說明兩因素交互作用越明顯,并且顏色越深變化加劇[16]。由3D 響應圖可知溶劑與溫度、料液比交互作用顯著,響應面存在極值,由等高圖可得提取溫度對綜合得分的影響大于提取溶劑與料液比。
圖3 提取溶劑(A)、提取溫度(B)、料液比(C)交互作用Fig 3 Interaction of extraction solvent(A),extraction temperature(B)and solid-liquid ratio(C)
最后得到姜制天麻最佳工藝條件為70%乙醇提取溶劑,提取溫度78.49℃,料液比1∶15,天麻素,天麻苷元,對羥基苯甲酸及巴利森苷A、B、C、E 和綜合得分預測值分別為0.2641、0.0066、0.0107、0.2759、0.11676、0.1170、0.3294、1.7599 mg·g-1?;诖?,結合單因素和實際生產考慮,姜制天麻工藝條件可為清蒸切片潤制,70%乙醇、80 ℃、1∶15 超聲提取40 min。
2.6.4 驗證試驗 精密稱取1.0000 g 姜天麻3 份,按照優(yōu)選最佳工藝進行提取,結果平均綜合評分為1.8083 與模型預測值(1.7599)相近,相對誤差小于5%。
課題組前期相繼開展了姜天麻炮制前后主成分差異、藥效等方面研究[17-19],證實了天麻經(jīng)姜制后可使其藥效增強,并與炮制后的變化成分密切相關,但未就姜天麻有效成分提取工藝開展研究。而響應曲面法依據(jù)試驗中的隨機誤差,可連續(xù)對試驗中各個水平進行分析,能用相對較少的試驗次數(shù),對試驗因素水平中的交互作用做較全面的分析[20-22]。因此,本試驗采用響應曲面設計法對姜天麻提取工藝進行優(yōu)選。
對天麻化學成分研究,常選擇天麻素和天麻苷元為主,其工藝優(yōu)化也多局限于單個成分。但隨著研究的深入,天麻中酚類成分更多地被證實為其入血效應成分。如巴利森苷A、B 分別具有改善學習記憶力、抗哮喘等作用[23-25]。為此,本試驗在考察提取時間、提取溫度、料液比、提取溶劑、提取粒徑等單因素試驗的基礎上,選取提取溶劑、料液比和提取溫度的交互作用進行響應曲面試驗,以天麻素,天麻苷元,對羥基苯甲酸,巴利森苷A、B、C、E 為指標進行綜合評價,建立了天麻7 種主要成分UPLC 含量測定方法,確定“建昌幫”姜天麻最佳提取工藝,且綜合評價優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行,響應模型擬合度良好,達到工藝優(yōu)化目的。
表4 差分析Tab 4 Variance analysis