王峰，何昕，錢懿軼（. 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)沙 400；2. 云南省阜外心血管病醫(yī)院藥劑科，昆明 650000；. 昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院，昆明 650500）

達(dá)比加群酯是一類新型口服抗凝劑（novel oral anticoagulants，NOACs），屬非肽類直接凝血酶抑制劑。因其與傳統(tǒng)抗凝藥如華法林相比，給藥劑量相對(duì)固定，治療過程中無需頻繁進(jìn)行劑量調(diào)整和凝血功能監(jiān)測(cè)，用藥依從性較高[1-2]，所以于2013年在國(guó)內(nèi)上市后廣泛用于非瓣膜性房顫成人患者的卒中和全身性栓塞預(yù)防[3]。然而，抗凝治療本身具有長(zhǎng)期性、個(gè)體差異性和出血高風(fēng)險(xiǎn)性等特點(diǎn)，達(dá)比加群酯導(dǎo)致的出血風(fēng)險(xiǎn)也隨著該藥的逐漸應(yīng)用而受到廣泛關(guān)注。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局建議將達(dá)比加群血藥濃度控制在40 ～200 ng·mL－1[4]，提示達(dá)比加群血藥濃度水平或可作為預(yù)測(cè)該藥療效和不良反應(yīng)的有效指標(biāo)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性[5]，本研究擬建立一種人血漿中達(dá)比加群濃度的LC-MS/MS 測(cè)定法，并引入一種閥切換技術(shù)，以自身為內(nèi)標(biāo)，達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測(cè)并易于推廣的效果，為促進(jìn)達(dá)比加群酯安全合理用藥，優(yōu)化抗凝策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

達(dá)比加群對(duì)照品（加拿大Toronto Research Chemicals 公司，純度＞98%，批號(hào)：1-JYS-153-1）；甲醇、乙腈為色譜級(jí)（美國(guó)Anaqua Chemicals公司）；甲酸、氨水為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；空白馬血清（北京政博偉業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)：180824）。

LCMS-8050 型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（日本島津公司）；色譜系統(tǒng)包括LC-30AD 型色譜泵、SIL-30AC 型自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A 型控制器；MSMate 9600 全自動(dòng)二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）；Milli-Q plus 純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aston SN 苯基柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（含4 mmol·L－1甲酸、氨水）＝33∶67（V/V）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：1 μL；等度洗脫。

每份待測(cè)樣品自動(dòng)進(jìn)樣的同時(shí)，二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜耦合儀自動(dòng)抽去設(shè)定劑量的樣品溶液作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存于耦合儀中，再通過閥切換裝置，在進(jìn)樣后0.4 min，將預(yù)先儲(chǔ)存在耦合儀中的內(nèi)標(biāo)溶液（6.24 ng·mL－1）注入色譜柱中分析，進(jìn)而達(dá)到待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)為同一物質(zhì)，但在不同時(shí)間出峰的效果，第一個(gè)為目標(biāo)峰，第二個(gè)為自校內(nèi)標(biāo)峰。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子化源（ESI）正離子模式檢測(cè)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）掃描；定性分析檢測(cè)離子對(duì)：m/z472.15/172.05，碰撞電壓：－25 V；定量分析檢測(cè)離子對(duì)：m/z472.15/289.10，碰撞電壓：－20 V；駐留時(shí)間：497 ms；脫溶劑氣溫度：250℃；接口溫度：300 ℃；加熱塊溫度：350℃；霧化氣（氮?dú)猓┝魉伲? L·min－1；加熱氣：氮?dú)饬魉?0 L·min－1，空氣流速10 L·min－1；碰撞氣（氬氣）壓力：270 kPa；接口電壓：4 kV。

2.3 溶液配制與血漿樣品處理

2.3.1 溶液配制 精密稱取達(dá)比加群對(duì)照品5.31 mg，用甲醇定容至50 mL，制備104.08 μg·mL－1的達(dá)比加群儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液先用空白馬血清制備成5.204 μg·mL－1的達(dá)比加群標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用空白馬血清逐步稀釋為5.204、26.02、52.04、104.08、260.2、520.4 ng·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品和低、中、高3 種濃度（10、100、400 ng·mL－1）的質(zhì)控樣品。另取儲(chǔ)備液，用甲醇制備成6.24 ng·mL－1的內(nèi)標(biāo)工作液。上述溶液均保存于－20 ℃冰箱。

2.3.2 人血漿/馬血清樣本處理 精密吸取人血漿/馬血清樣品200 μL 置于1.5 mL EP 管中，精密加入蛋白沉淀劑（乙腈-甲醇＝80∶20，V/V）500 μL，室溫下渦旋振蕩1 min 后，14 500 r·min－1離心8 min，取500 μL 上層清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中待測(cè)分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 分別制備空白溶劑、空白馬血清、空白人血漿、空白馬血清＋達(dá)比加群對(duì)照品（30 ng·mL－1，50 ng·mL－1）、用藥患者給藥后血漿樣本，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析。典型色譜圖見圖1，空白試劑、空白馬血清和空白人血漿在待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)峰處無干擾，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為1.26 min 和1.81 min，峰形良好。

圖1 典型色譜圖Fig 1 Typical chromatograms

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 按“2.3.1”項(xiàng)下方法配制標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，再按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行分析，以達(dá)比加群待測(cè)物質(zhì)量濃度（ng·mL－1）為橫坐標(biāo)（x）、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.0092x＋0.0358（r＝0.9997），表明達(dá)比加群在5.204 ～520.4 ng·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好，定量下限為5.204 ng·mL－1。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度 取“2.3.1”項(xiàng)下高（400 ng·mL－1）、中（100 ng·mL－1）、低（10 ng·mL－1）質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品和5.204 ng·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品（作為定量下限濃度樣品），按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度制備5 份樣品，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品的測(cè)定濃度，計(jì)算得質(zhì)控樣品和定量下限濃度樣品日內(nèi)、日間精密度RSD分別為1.4%～2.5%和1.0%～2.9%，準(zhǔn)確度分別為92.72%～111.54%和91.75%～113.16%。

2.4.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理高、中、低濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份，測(cè)得待測(cè)物峰面積為A；另取空白馬血清處理后取上清液，加入與高、中、低濃度質(zhì)控樣品相對(duì)應(yīng)的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度制備5份樣品，測(cè)得待測(cè)物峰面積為B；取同體積超純水代血漿，按“2.3.1”項(xiàng)下方法配制高、中、低相應(yīng)濃度的樣品，直接進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份，測(cè)得待測(cè)物峰面積為C。按下列公式計(jì)算：提取回收率＝A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)＝B/C×100%。結(jié)果見表1，表明本測(cè)定法提取回收率較高，測(cè)定過程無明顯基質(zhì)效應(yīng)。

表1 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果(n ＝5)Tab 1 Extraction recovery and matrix effect (n ＝5)

2.4.5 穩(wěn)定性 高、中、低濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度制備5 份樣品，分別于不同條件下放置，再按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理并分析，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份，考察不同條件下穩(wěn)定性?？疾鞐l件及結(jié)果見表2。

表2 不同條件下達(dá)比加群的穩(wěn)定性考察結(jié)果(n ＝5)Tab 2 Stability of dabigatran under various conditions (n ＝5)

2.5 方法學(xué)應(yīng)用

將本測(cè)定法應(yīng)用于20 例（男11 例，女9例）平均年齡（66.05±9.32）歲、服用達(dá)比加群酯膠囊患者的血藥濃度測(cè)定。所有患者以“110 mg q12 h”方案用藥，在末次給藥后10 ～14 h 空腹采血并立即分離血漿，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理并分析。測(cè)得20 例患者達(dá)比加群血藥濃度為25.1 ～257.0 ng·mL－1，平均值為（92.60±49.90）ng·mL－1。具體結(jié)果見表3。

表3 達(dá)比加群血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果及臨床應(yīng)用Tab 3 Blood drug concentration monitoring and clinical practice of dabigatran

3 討論

3.1 方法先進(jìn)性

內(nèi)標(biāo)法是LC-MS/MS 對(duì)生物樣本進(jìn)行定量分析時(shí)常采用的方法[6]，通過引入內(nèi)標(biāo)校正樣品預(yù)處理造成的損失、進(jìn)樣體積差異、基質(zhì)效應(yīng)對(duì)離子化過程的影響等因素造成的誤差。按照理想內(nèi)標(biāo)應(yīng)與待測(cè)物具備相似物理化學(xué)性質(zhì)這一原則，內(nèi)標(biāo)可分為同位素內(nèi)標(biāo)、待測(cè)物的結(jié)構(gòu)類似物以及與待測(cè)物質(zhì)譜行為相近的物質(zhì)[7]。其中，同位素內(nèi)標(biāo)與待測(cè)物在色譜保留、質(zhì)譜裂解等方面幾乎一致，因而應(yīng)用最為廣泛，已發(fā)表的LC-MS/MS 測(cè)定法，以達(dá)比加群-d3和[13C]-達(dá)比加群為內(nèi)標(biāo)者居多[8-11]。但同位素內(nèi)標(biāo)往往價(jià)格高昂、獲取難度大，測(cè)定成本較高，不利于實(shí)現(xiàn)常規(guī)化監(jiān)測(cè)。本研究參考“多維”概念，借助二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜耦合儀，引入閥切換技術(shù)，首次建立了一種以待測(cè)物達(dá)比加群自身為內(nèi)標(biāo)的人血漿中達(dá)比加群濃度LC-MS/MS 測(cè)定法，以固定濃度的達(dá)比加群標(biāo)準(zhǔn)溶液為內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)的“二維”進(jìn)樣和“一維”色譜分離。同時(shí)本法采用等度洗脫，簡(jiǎn)化了色譜條件，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為1.26 min 和1.81 min，每份樣品從樣品進(jìn)樣、內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣和分析時(shí)長(zhǎng)僅為2.4 min，與文獻(xiàn)方法相比縮短了分析時(shí)間，提升了分析效率，較好地實(shí)現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)、快速、高效測(cè)定的目的，有利于臨床常規(guī)化開展達(dá)比加群血藥濃度監(jiān)測(cè)的推廣。

3.2 達(dá)比加群血藥濃度監(jiān)測(cè)的臨床意義探索

從本研究選取的20 例服用達(dá)比加群酯的患者血藥濃度數(shù)據(jù)分析，以110 mg q12 h 方案服用達(dá)比加群酯的患者，用藥6 次后，血藥濃度變異較大，且臨床觀察到的凝血指標(biāo)異常升高不良事件有可能與高血藥濃度有關(guān)，從患者的既往出血/栓塞不良事件史考慮，相同用法用量達(dá)比加群用于不同患者，或者同一患者不同時(shí)期以相同用法用量達(dá)比加群酯治療，均有可能存在療效和安全性的差異，提示患者在后續(xù)用藥過程中，有必要進(jìn)行達(dá)比加群血藥濃度監(jiān)測(cè)。雖然目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)到了一些達(dá)比加群血藥濃度的監(jiān)測(cè)方法[12-14]，但對(duì)臨床應(yīng)用價(jià)值尚無探索。RE-LY 研究[15]數(shù)據(jù)提示達(dá)比加群酯活性代謝物濃度存在較大個(gè)體差異與CES1和ABCB1基因多態(tài)性相關(guān)，提示達(dá)比加群血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)進(jìn)一步揭示藥效學(xué)差異，促進(jìn)臨床合理用藥具有重要的意義，且該方法有希望成為一個(gè)相較于肌酐清除率和凝血檢查指標(biāo)如部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、蛇毒凝血時(shí)間（ECT）、稀釋凝血時(shí)間（dTT）、凝血酶時(shí)間（TT）和稀釋的蝰蛇毒時(shí)間（dRVVT）等指標(biāo)更精準(zhǔn)、快速和經(jīng)濟(jì)的監(jiān)測(cè)方法[16]。隨著達(dá)比加群酯的特異性拮抗劑idarucizumab 獲批上市[17]，除了為達(dá)比加群酯用藥安全性和藥效提供評(píng)估依據(jù)之外，達(dá)比加群血藥濃度還有可能為特異性拮抗劑的個(gè)體化用藥提供指引，同時(shí)隨著我國(guó)藥品一致性評(píng)價(jià)政策[18]的推進(jìn)，達(dá)比加群血藥濃度監(jiān)測(cè)也有助于同類國(guó)產(chǎn)新藥的研發(fā)。

4 結(jié)論

本研究首次以達(dá)比加群自身為內(nèi)標(biāo)，以LCMS/MS 方法測(cè)定達(dá)比加群血藥濃度并初步應(yīng)用于臨床，方法新穎，樣品處理簡(jiǎn)單，分析過程快速、高效，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于達(dá)比加群血藥濃度的測(cè)定。該方法的初步臨床應(yīng)用結(jié)果顯示，有較好的臨床應(yīng)用前景并更好地促進(jìn)達(dá)比加群酯的個(gè)體化用藥。