付昆，楊艷，陸一菱，仲蓬，何春楊，徐敏（成都市第三人民醫(yī)院，西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，成都 610031）

伏九貼敷是本院開展的特色中醫(yī)外治療法，由白芥子、甘遂、延胡索、細(xì)辛組成，通過藥物透皮作用和穴位刺激共同作用防治哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病。因該療法選用帶有刺激性的藥物，引起局部充血、發(fā)泡促進(jìn)藥物的吸收，故而對皮膚刺激性較大。組方中白芥子藥物為皮膚刺激性的源頭，生白芥子刺激性強(qiáng)于炒白芥子。本課題組前期就此療法皮膚刺激性與抗哮喘作用相關(guān)性進(jìn)行了研究[1]，發(fā)現(xiàn)伏九貼敷藥物中生白芥子和炒白芥子的比例各半時，既可維持療效，又能減輕其對皮膚的副作用。故本研究以該生、炒白芥子配比處方劑量探討伏九貼敷藥物的抗哮喘作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量180 ～220 g[成都達(dá)碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（川）2019-189]。于18 ～25℃，12 h 明暗周期交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，自由飲水、進(jìn)食。

1.2 試藥

醋延胡索、醋甘遂、生芥子、炒芥子、細(xì)辛均購自四川省中藥飲片有限公司，批號分別為200318、190524、200506、191203、200420，由成都市食品藥品檢驗研究院文永盛主任藥師鑒定為正品。按芥子∶延胡索∶甘遂∶細(xì)辛＝2（生、炒各半）∶1∶1∶1 比例將各藥物粉碎為100 目細(xì)粉混合，以生姜汁調(diào)成糊狀制成伏九貼敷藥物備用。

卵蛋白（OVA，貨號：A5253，Sigma 公司），Al（OH）3（批號：20161130，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），地塞米松磷酸鈉注射液（批號：2001202，國藥集團(tuán)容生制藥有限公司），三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（批號分別為10006818、80109218、10009218，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蘇木素、PAS 試劑盒（武漢谷歌生物），Trizol（Invitrogen），HyPure Molecular Biology Grade Water（HyClone），5×All-In-One RT Master Mix、EvaGreen Express 2×qPCR Master Mix-No Dye（abcam）。

1.3 儀器

PL-203 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，NE-C801 壓縮式霧化器[歐姆龍（大連）有限公司]，JJ-12J 脫水機(jī)、JB-P5 包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司），RM2016 切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司），KZ-II 勻漿儀（賽維爾生物），D3024R 高速冷凍型微型離心機(jī)（SCILOGEX），SLAN-96S PCR analysis system（上海宏石醫(yī)療科技有限公司），K2800 核酸分析儀（北京凱奧科技發(fā)展有限公司），Eclipse E100光學(xué)顯微鏡（Nikon）。

2 方法

2.1 模型建立

實驗第1日、7日于大鼠腹腔注射1 mL 含有OVA（100 mg）、氫氧化鋁（100 mg）的混合液致敏。第15日開始，每日給予大鼠1% OVA 霧化吸入，激發(fā)哮喘，每日1 次，每次20 min，連續(xù)7 d。密切觀察大鼠激發(fā)后的反應(yīng)情況：有無呼吸急促、喘息、發(fā)紺等癥狀，行動有無改變。以大鼠出現(xiàn)煩躁嗆咳、呼吸加快、幅度加大、點頭呼吸運(yùn)動、腹肌痙攣、頻繁撓鼻及站立不穩(wěn)、豎毛等典型哮喘樣發(fā)作癥狀為激發(fā)成功。

2.2 分組與給藥

將30 只SD 大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組：正常組、模型組、假貼敷組、伏九貼敷藥物組和地塞米松組。除正常組外，其余各組大鼠按“2.1”項下方法造模。正常組大鼠同法于第1日、7日腹腔注射生理鹽水1 mL，第15日開始以生理鹽水同法霧化吸入，連續(xù)7 d。末次霧化后，正常組和模型組不做任何處理。伏九貼敷藥物組大鼠用8% Na2S 進(jìn)行脫毛，第2日取調(diào)制好的伏九貼敷藥物適量，按照《實驗針灸學(xué)》取穴方法[2]敷于大椎、肺腧（雙側(cè)）、腎腧（雙側(cè)）穴并用膠布固定，每次貼敷4 h，隔日貼敷1 次，共給藥7 次。假貼敷組同樣貼上無藥空白膠布。地塞米松組腹腔注射地塞米松0.5 mg·kg－1，隔日1 次，共給藥7 次。

2.3 肺組織氣道病理考察

末次給藥24 h 后處死大鼠，取右肺組織固定24 h。石蠟包埋、3 μm 切片；脫蠟，依次高碘酸→Schiff 試劑→蘇木素染色；中性樹膠封片，顯微鏡觀察PAS 染色結(jié)果，并根據(jù)支氣管周圍PAS 染色陽性細(xì)胞密集程度進(jìn)行病理評分，0 分：無或偶見；1 分：稀疏、散在；2 分：較密集；3 分：大量。

2.4 肺組織輔助性T 細(xì)胞17（Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的檢測

取肺組織100 mg 置于無RNA 酶的離心管中勻漿，12 000 r·min－1離心10 min，取上清液，Trizol 抽提總RNA，核酸分析儀檢測RNA 濃度及純度。采用5×All-In-One RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄RNA，配制20 μL 反應(yīng)體系以轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 10 μL，7.5 μmol·L－1primer 1.2 μL，Template 2.0 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 變性15 s，60℃ 退火60 s，40 個循環(huán)。60℃→95℃，每15 s 升溫0.3℃進(jìn)行熔解曲線分析。以β-actin為內(nèi)參基因，檢測目標(biāo)基因和β-actinCt值，采用2－△△Ct法（△Ct＝Ct目標(biāo)基因－Ctβ-actin）計算mRNA的相對表達(dá)量。各mRNA 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 檢測各基因引物信息Tab 1 Primers of various genes for qRT-PCR determination

2.5 統(tǒng)計方法

正態(tài)分布的定量資料以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析檢驗，若方差齊采用LSD 法進(jìn)行多重比較，方差不齊則用Dunnett’s T3檢驗；非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)秩和檢驗，數(shù)據(jù)則以中位數(shù)（四分位間距）表示。采用Pearson 積差法進(jìn)行相關(guān)分析。以SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05 認(rèn)為組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 伏九貼敷藥物對哮喘大鼠肺組織氣道炎癥病理變化的影響

杯狀細(xì)胞及黏液細(xì)胞數(shù)量可以反映氣道黏液分泌情況[3]。肺組織樣本經(jīng)PAS 染色后，鏡檢可見支氣管上皮細(xì)胞中PAS 陽性細(xì)胞數(shù)量的改變明顯。正常組大鼠支氣管上皮細(xì)胞中幾乎未查見PAS 陽性細(xì)胞，在模型組和假貼敷組大鼠中容易見到支氣管上皮較多的PAS 陽性細(xì)胞，伏九貼敷藥物組和地塞米松組PAS 陽性細(xì)胞則相對稀疏，如圖1 所示。通過半定量評分顯示，模型組氣道上皮PAS染色陽性細(xì)胞密集程度計分為1.5（1，2.25）[數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位間距）表示，下同]明顯高于正常組0（0，0），表明哮喘大鼠氣道黏液分泌增多，炎癥反應(yīng)重；而假貼敷組評分為1（1，3）和模型組比較無明顯差異，說明空白膠布貼敷對哮喘并沒有治療作用。伏九貼敷和地塞米松組陽性細(xì)胞密集程度評分均為0（0，0.25），明顯低于模型組。

圖1 伏九貼敷藥物對哮喘大鼠肺組織氣道PAS 陽性細(xì)胞病理改變的影響（Bar ＝100 μm）Fig 1 Effect of Fujiu patching medicine on the pathological alterations of PAS positive cells in the lung airway epithelium of asthmatic rat models（Bar ＝100 μm）

3.2 伏九貼敷藥物對哮喘大鼠Th17、Treg 細(xì)胞因子及特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

從圖2 可以看出，與正常組比較，模型組肺中TNF-α、IL-1β、IL-17、RORγt mRNA 相對表達(dá)量升高（P＜0.01 或P＜0.05），IL-10 和Foxp3 mRNA的表達(dá)降低（P＜0.01），IL-17/IL-10 和RORγt/Foxp3表達(dá)升高（P＜0.01）。與模型組比較，假貼敷組的Foxp3 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），其余各基因的mRNA 表達(dá)水平無差異。與模型組比，給予伏九貼敷藥物后，TNF-α、IL-1β、IL-17、RORγt mRNA 的表達(dá)水平下調(diào)，而IL-10 和Foxp3 mRNA 的表達(dá)量增加，IL-17/IL-10 和RORγt/Foxp3 比值降低（P＜0.01或0.05），陽性藥地塞米松對上述mRNA 顯示出同樣的調(diào)控效果。

圖2 伏九貼敷藥物對各組大鼠肺中基因mRNA 相對表達(dá)量的影響（*P ＜0.05，**P ＜0.01）Fig 2 Effect of Fujiu patching medicine on the relative mRNA expressions of various genes in the lung of different rats（*P ＜0.05，**P ＜0.01）

3.3 相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析顯示，哮喘大鼠肺IL-17 和RORγt 的表達(dá)水平與炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1β表達(dá)成正相關(guān)（P＜0.01）；IL-17/IL-10 和RORγt/Foxp3 表達(dá)量比值與TNF-α、IL-1β表達(dá)水平成正相關(guān)（P＜0.001）；而IL-10 和Foxp3 表達(dá)水平則與TNF-α、IL-1β表達(dá)成顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001）。分析結(jié)果見圖3。

圖3 大鼠肺組織各mRNA 表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果Fig 3 Correlation among various mRNA expressions in the lung tissue of rat

4 討論

哮喘是多種細(xì)胞和細(xì)胞成分參與的慢性氣道炎癥性疾病，可引起炎癥、黏液分泌過多、血管再生和氣道重塑[4]。免疫功能異常被認(rèn)為是哮喘發(fā)生發(fā)展的病機(jī)，其中Th 起著至關(guān)重要的作用[5]。Th17 細(xì)胞能釋放IL-17，并間接招募中性粒細(xì)胞和聚集嗜酸性粒細(xì)胞，進(jìn)一步加重哮喘發(fā)作[6-7]。而表達(dá)叉頭盒蛋白3（Foxp3）轉(zhuǎn)錄因子的CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細(xì)胞具有維持自身耐受的功能[8]，它通過IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子發(fā)揮作用，主要參與免疫應(yīng)答和其他免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，進(jìn)而將與T 細(xì)胞有關(guān)的免疫應(yīng)答控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，避免對機(jī)體的損害[9]。不少證據(jù)表明，哮喘是通過Treg 細(xì)胞及其細(xì)胞因子來抑制的，而Th17 細(xì)胞及其細(xì)胞因子則會加重哮喘的癥狀，揭示了這些細(xì)胞的活性與哮喘的病理和治療效果有關(guān)[10]。因此，Th17/Treg 及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17/IL-10 的失衡也是哮喘發(fā)病機(jī)制的重要病理生理基礎(chǔ)[11]，恢復(fù)Th17/Treg 免疫平衡是治療哮喘的關(guān)鍵，目前已成為研究領(lǐng)域的熱點。Th17 細(xì)胞的分化受維A 酸相關(guān)孤兒受體γt（RORγt）的特異性調(diào)控，CD4＋T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞的分化往往伴隨著家族特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt 和標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17 的表達(dá)[12-13]。另一方面，F(xiàn)oxp3 是Treg 細(xì)胞不可缺少的主要轉(zhuǎn)錄因子，它的穩(wěn)定表達(dá)對Treg 細(xì)胞的發(fā)育和功能至關(guān)重要，F(xiàn)oxp3 缺乏會導(dǎo)致CD4＋T 細(xì)胞向Treg 細(xì)胞分化不足[14]。Foxp3 可通過與RORγt 的直接相互作用抑制Th17細(xì)胞的分化[15]。因此RORγt 與Treg 細(xì)胞的Foxp3在功能上相互制約，成為維持Th17/Treg 細(xì)胞平衡的關(guān)鍵[16]。

哮喘的本質(zhì)是變態(tài)反應(yīng)性疾病。當(dāng)過敏原進(jìn)入體內(nèi)時，T 細(xì)胞和B 細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生IgE 抗體，激活肥大細(xì)胞。肥大細(xì)胞脫顆粒，分泌IL-1β、TNF-α、MIP-1α、IL-13 等細(xì)胞因子和各種趨化因子，這些細(xì)胞因子共同作用引起白細(xì)胞浸潤和持續(xù)炎癥[17-18]。哮喘的慢性氣道炎癥組織學(xué)特征可表現(xiàn)為支氣管黏膜杯狀細(xì)胞增生，黏液分泌過多等。PAS 陽性細(xì)胞多少可間接反映氣道炎癥的杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌情況[3]。本實驗通過OVA/Al（OH）3聯(lián)合造模發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠肺組織氣道黏膜上皮PAS 陽性細(xì)胞密集，存在大量杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌，病理改變評分顯著高于正常組，氣道炎癥反應(yīng)嚴(yán)重。此外，模型組Th17 相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、特異轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA 表達(dá)水平升高，說明Th17 細(xì)胞分化優(yōu)勢明顯；而IL-10、Foxp3 mRNA 表達(dá)出現(xiàn)下降，提示Treg 細(xì)胞發(fā)育和功能受阻，使得IL-17/IL-10 和RORγt/Foxp3 比值上升，哮喘大鼠體內(nèi)出現(xiàn)了向Th17 優(yōu)勢分化的Th17/Treg 失衡。機(jī)體免疫平衡被打破，繼而出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，大量炎性細(xì)胞因子釋放，TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)增加，最終引起哮喘大鼠的氣道炎癥反應(yīng)。從相關(guān)性分析結(jié)果也可以看出，Th17 相關(guān)的IL-17 和RORγt 的表達(dá)水平與炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1β表達(dá)正相關(guān)，而Treg 相關(guān)的IL-10 和Foxp3 表達(dá)水平與之負(fù)相關(guān)。提示Th17 可能為促炎因素，而Treg 可能抑制炎癥因子表達(dá)。同時IL-17/IL-10、RORγt/Foxp3 比值也和炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)正相關(guān)，說明如果IL-17 和RORγt 表達(dá)下調(diào)的同時IL-10、Foxp3 表達(dá)增加可使IL-17/IL-10 及RORγt/Foxp3 比值降低，炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)會隨之減少。IL-17/IL-10、RORγt/Foxp3 比值的下降預(yù)示著Th17/Treg 平衡在重新恢復(fù)，機(jī)體免疫功能增強(qiáng)，哮喘炎癥反應(yīng)可隨之改善。

本院開展的伏九貼敷是以清代醫(yī)家張璐發(fā)明的中藥白芥子外涂法為基礎(chǔ)，由白芥子、延胡索、細(xì)辛、甘遂組成，臨床外治哮喘療效確切，為其藥物作用機(jī)制研究提供了可靠依據(jù)。方中作為君藥的白芥子的主要成分有白芥子苷、芥子酶、芥子堿等。白芥子苷經(jīng)過芥子酶的作用，可水解生成硫代異氰酸對羥芐酯，該成分能使皮膚發(fā)紅甚至發(fā)泡，從而破壞皮膚屏障功能，促藥滲透。此外，白芥子醇提物對炎癥早期的水腫和滲出有明顯的抑制作用[19]。延胡索在方中與白芥子皆為主藥，其主要成分為延胡索乙素，具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用，本方取其行氣活血止痛之功效，可以起到加強(qiáng)或促進(jìn)其他藥物吸收、減輕皮膚刺激、緩解疼痛的效果。細(xì)辛中的α-細(xì)辛腦可松弛支氣管平滑肌，減輕黏膜充血和水腫，緩解下呼吸道阻塞。L-細(xì)辛脂素可能通過抑制T 細(xì)胞的增殖與活化，抑制氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)來抑制速發(fā)型哮喘反應(yīng)[20]。生甘遂醇提取物具有強(qiáng)烈刺激性，方中應(yīng)用可能為取其對皮膚的刺激性，助力其他藥物有效成分通過皮膚滲透到氣管、肺等組織中發(fā)揮作用?？v觀全方，四味藥多組分協(xié)同作用，共奏抗炎平喘之效。本文試圖從分子水平以Th17/Treg 平衡為切入點進(jìn)一步揭示伏九貼敷藥物防治哮喘的機(jī)制。結(jié)果顯示，伏九貼敷藥物可以明顯減少哮喘模型大鼠的氣道上皮杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌，有效緩解哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。并且可以下調(diào)IL-17、RORγt mRNA 表達(dá)水平，同時上調(diào)IL-10、Foxp3mRNA 的表達(dá)，使IL-17/IL-10、RORγt/Foxp3 比值重新趨于平衡，重塑Th17/Treg免疫平衡，從而減少炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的表達(dá)量，最終減輕肺組織氣道炎癥，發(fā)揮抗哮喘作用。由此可見，對Th17/Treg 失衡的影響可能是伏九貼敷藥物治療哮喘的作用機(jī)制之一。

伏九貼敷通過穴位貼敷使腧穴局部皮膚充血，促進(jìn)藥物的吸收；繼而發(fā)揮全身作用，使免疫系統(tǒng)發(fā)生相應(yīng)的改變，以達(dá)到抗炎、平喘及提高機(jī)體免疫力的目的。從臨床報道看，伏九貼敷能有效緩解哮喘癥狀，減少發(fā)作次數(shù)，增強(qiáng)患者的抵抗力，遠(yuǎn)期療效較好，不良反應(yīng)少，尤其是在治療哮喘緩解期及協(xié)助西藥鞏固發(fā)作期療效、降低西藥不良反應(yīng)方面具有特殊優(yōu)勢[21]，具備積極推廣運(yùn)用的價值。為此，本文從Th17/Treg 平衡角度淺析了伏九貼敷藥物影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗哮喘作用機(jī)制，為該療法臨床應(yīng)用提供了一定的理論支持，但更深入的作用機(jī)制以及透皮吸收的量效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。