陳壯麗 盧 維 李杰輝

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧市 530023，電子郵箱：914453972@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)面修復(fù)、周圍血管科，南寧市 530023)

【提要】 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，糖尿病的患病人數(shù)逐年增加，糖尿病性潰瘍等相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重地威脅居民的健康。糖尿病性潰瘍動(dòng)物模型的制備有利于深入研究糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的發(fā)病機(jī)制，為臨床診治疾病提供強(qiáng)有力的科研證據(jù)和藥物作用機(jī)制。本文就糖尿病性潰瘍動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀及其進(jìn)展進(jìn)行綜述。

糖尿病是常見的慢性疾病之一，糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥已經(jīng)成為威脅我國(guó)居民健康的重大問題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全球約有4.51億人(18～99歲)患有糖尿病，預(yù)計(jì)到2045年糖尿病患病人數(shù)將增至6.93億[1]。研究顯示，大多數(shù)糖尿病足是由缺血性、神經(jīng)病理性或混合性神經(jīng)缺血性異常引起，是糖尿病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一[2]。與正常人的創(chuàng)面相比，糖尿病患者由于長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)，其創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等)發(fā)生病變、血管內(nèi)皮損傷，創(chuàng)面潰瘍難愈合且反復(fù)難治[3]。隨著對(duì)糖尿病性潰瘍發(fā)病機(jī)制研究的逐步深入，其治療手段也取得很大進(jìn)步，如抗感染、負(fù)壓引流、高壓氧療、生長(zhǎng)因子、分子生物學(xué)和組織工程技術(shù)、中醫(yī)中藥等對(duì)糖尿病性潰瘍均有一定的療效。實(shí)驗(yàn)研究可為疾病的治療提供科研證據(jù)，因此，糖尿病潰瘍動(dòng)物模型的建立對(duì)研究糖尿病性潰瘍具有一定意義。本研究主要闡述糖尿病性潰瘍動(dòng)物模型的制備及其研究近況。

1 糖尿病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法

目前，大多數(shù)研究選擇鼠類作為糖尿病動(dòng)物模型，構(gòu)建方法主要有鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射誘導(dǎo)法或者STZ注射結(jié)合高糖高脂飼料喂養(yǎng)法，或者直接選擇自發(fā)性動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因糖尿病動(dòng)物模型(基因敲除糖尿病動(dòng)物模型)。但對(duì)于造模過程中的血糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)時(shí)間和STZ劑量問題，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

1.1 STZ誘導(dǎo)法 化學(xué)藥物在誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型中得到廣泛應(yīng)用，由于STZ具有毒性小、穩(wěn)定性好、成模速度快等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用，其藥物可通過激活機(jī)體自身免疫選擇性，導(dǎo)致胰島B細(xì)胞壞死、胰島素缺乏，使血糖升高或者產(chǎn)生針對(duì)胰島B細(xì)胞的自身抗體，誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。有研究顯示，多次小劑量(50 mg/kg)STZ腹腔注射較單次大劑量(150 mg/kg)注射能更有效地建立糖尿病小鼠模型[4]。多次腹腔注射STZ(60 mg/kg或70 mg/kg)誘導(dǎo)小鼠成模率高且血糖水平穩(wěn)定，可持續(xù)損傷胰島細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體自身免疫系統(tǒng)紊亂，與臨床上Ⅰ型糖尿病的發(fā)病機(jī)制相似[5-6]。

1.2 高脂飲食結(jié)合STZ誘導(dǎo)法 本法先通過高脂飲食使鼠類產(chǎn)生胰島素抵抗，之后腹腔注射STZ破壞胰島細(xì)胞，研究顯示，該方法可提高成模率、模型穩(wěn)定性及變異性，目前應(yīng)用較為廣泛。例如，陳欣等[7]采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD大鼠一段時(shí)間(1個(gè)月)后，連續(xù)給予小劑量STZ(25 mg/kg)腹腔注射2 d，結(jié)果顯示該法可以構(gòu)建穩(wěn)定的Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型[7]。李友山等[8]采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠(80～100 g)1個(gè)月后，單次腹腔注射 STZ 40 mg/kg，可構(gòu)造較為可靠的糖尿病大鼠模型。此研究在糖尿病大鼠模型基礎(chǔ)上，人為創(chuàng)建潰瘍創(chuàng)面，動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)面愈合過程。此造模方法可以觀察到糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的組織病理學(xué)特點(diǎn)，為研究糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的機(jī)制和治療提供思路。以上文獻(xiàn)提示高糖高脂飲食喂養(yǎng)1～2個(gè)月左右，可誘發(fā)大鼠胰島素抵抗，同時(shí)聯(lián)合STZ注射可誘導(dǎo)胰島細(xì)胞損傷從而構(gòu)建糖尿病大鼠模型[9]，但不同的STZ給藥劑量，糖尿病的病情會(huì)有所差異[10]，但不可否認(rèn)的是該方法可獲得較穩(wěn)定的糖尿病動(dòng)物模型。

1.3 自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型 自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型是動(dòng)物自然發(fā)生糖尿病，或通過遺傳培育保留的糖尿病模型，該模型與人類Ⅱ型糖尿病的臨床癥狀相似，常用于建立模型的動(dòng)物有db/db小鼠、ob/ob小鼠、KK-AY小鼠、GK大鼠等[11]。db/db小鼠是模擬人類Ⅱ型糖尿病模型的良好動(dòng)物，此小鼠變異程度高，具有穩(wěn)定的高血糖、胰島素抵抗和血脂異常等狀態(tài)，適用于臨床上對(duì)糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的研究[12-13]。池駿等[14]通過敲除瘦素基因建立糖尿病小鼠模型，該小鼠模型具有自發(fā)性、高重復(fù)性和穩(wěn)定的Ⅱ型糖尿病癥狀表型等特點(diǎn)，瘦素基因敲除小鼠與ob/ob小鼠較相似，為糖尿病相關(guān)疾病的研究提供了重要的造模條件，但瘦素基因缺陷導(dǎo)致的糖尿病在臨床上極為少見，與患者發(fā)病機(jī)制存在一定差異。KK-AY小鼠是KK小鼠通過轉(zhuǎn)入黃色肥胖基因而形成的一種糖尿病動(dòng)物模型，此小鼠可用于建立多種糖尿病并發(fā)癥模型，如糖尿病腎病模型、肝損害模型等，但由于其對(duì)飼養(yǎng)條件的要求較高，在實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用有一定局限性[15]。GK鼠類糖尿病動(dòng)物模型具有穩(wěn)定的葡萄糖耐受和胰島素抵抗，適用于構(gòu)建非肥胖糖尿病動(dòng)物模型，相比于高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)建立的糖尿病動(dòng)物模型來說，GK大鼠模型具有更好的遺傳穩(wěn)定性，更適合應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究[16]?？偟膩碚f，在關(guān)于糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的研究中，db/db小鼠、ob/ob小鼠糖尿病模型是較常見的動(dòng)物模型。但由于自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型的價(jià)格昂貴且不易獲得、對(duì)飼養(yǎng)條件要求過高，故而較少應(yīng)用于科研實(shí)驗(yàn)中。

1.4 基因工程動(dòng)物模型 基因工程動(dòng)物模型(基因敲除糖尿病動(dòng)物模型)是運(yùn)用DNA靶向修飾技術(shù)，通過基因敲除或修飾改變相關(guān)糖代謝基因的表達(dá)，導(dǎo)致糖代謝紊亂，從而建立相關(guān)動(dòng)物模型，如相關(guān)位點(diǎn)胰島素受體底物1、2基因的敲除。除此之外，還可以通過敲除相關(guān)基因，如Unc13基因、PDHA1基因等，建立糖尿病動(dòng)物模型并應(yīng)用于糖尿病疾病及相關(guān)并發(fā)癥的實(shí)驗(yàn)研究中[17-18]。但轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)的操作和制備難度較大，價(jià)格昂貴且不易獲取，因而在一般的實(shí)驗(yàn)研究中難以廣泛開展應(yīng)用。

2 模擬病理因素的糖尿病性潰瘍動(dòng)物模型及其分類

實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物從患病到形成潰瘍所需時(shí)間較長(zhǎng)，因此，一般采用人為模擬病理因素的方法來建立糖尿病性潰瘍模型，主要分為缺血性動(dòng)物潰瘍模型、神經(jīng)病變性動(dòng)物潰瘍模型、感染性動(dòng)物潰瘍模型。

2.1 缺血性動(dòng)物潰瘍模型

2.1.1 血管結(jié)扎法：下肢血管病變?nèi)毖菍?dǎo)致糖尿病足潰瘍的重要原因之一，基于此機(jī)制可以采用下肢血管結(jié)扎、離斷血管的方法建立下肢缺血性潰瘍模型。有學(xué)者采用腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型后，采用高位結(jié)扎股動(dòng)脈、股靜脈并斷離股動(dòng)脈的方法建立下肢缺血模型，并結(jié)合激光多普勒成像儀監(jiān)測(cè)血流變化，結(jié)果顯示，該方法建立的糖尿病潰瘍模型可進(jìn)行定量分析，可信度高[19]。但該模型通過下肢血管高位結(jié)扎和/或離斷下肢血管形成的急性缺血壞死病理改變，可能與臨床上由糖尿病引起的中、小及微血管慢性缺血病變導(dǎo)致的糖尿病性潰瘍有較大差異。高懷林等[20]采用高脂飲食+STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠后，對(duì)大鼠股動(dòng)脈及股靜脈進(jìn)行離斷，成功建立糖尿病足模型，并將其用于糖尿病足大鼠血管內(nèi)皮功能研究中。但此模型通過離斷股動(dòng)脈及股靜脈建立的糖尿病足病變，與臨床上糖尿病患者由于長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)導(dǎo)致血管病變甚至缺血，或同時(shí)伴有側(cè)支血管損傷的病理有一定差異。

2.1.2 皮膚壓迫法：有學(xué)者先腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型后，再利用磁片磁鐵相互吸引壓迫的方法誘導(dǎo)局部組織皮膚缺血-再灌注損傷而形成糖尿病大鼠潰瘍模型(將磁片植入大鼠背部，再通過外部磁鐵相互吸引產(chǎn)生壓力，從而造成皮膚局部缺血)，但由于實(shí)驗(yàn)過程未進(jìn)行實(shí)時(shí)、客觀地監(jiān)測(cè)血流，無法直接說明壓迫部位缺血-再灌注的過程；并且單一皮膚壓迫法誘導(dǎo)缺血形成的潰瘍與長(zhǎng)期糖尿病導(dǎo)致的慢性缺血病理改變存在很大的差異[21-23]。

2.2 神經(jīng)性病變動(dòng)物模型 屈璐等[24]采用高脂飲食+STZ誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病模型后，沿大鼠坐骨神經(jīng)解剖位置放置干凍袋，12周后檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度并觀察坐骨神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)，如出現(xiàn)坐骨神經(jīng)功能減退及病理形態(tài)改變即認(rèn)為糖尿病周圍神經(jīng)病變的大鼠模型構(gòu)建成功。但在科研實(shí)驗(yàn)中，較少單獨(dú)建立動(dòng)物神經(jīng)性病變潰瘍模型。

2.3 感染性動(dòng)物模型 感染是糖尿病性潰瘍常見的并發(fā)癥之一。在感染致病菌中，革蘭陰性菌和革蘭陽性菌所占比例均等，但常見單菌致病菌為金黃色葡萄球菌[25]。目前糖尿病感染性動(dòng)物模型的建立一般都采用皮下菌株注射。有學(xué)者采用STZ+高脂飲食誘導(dǎo)建立大鼠糖尿病模型后，使用恒溫恒壓燙傷儀燙傷大鼠背部下端皮膚(參數(shù)：溫度90℃，壓力9.8 N，探頭4 cm2，接觸時(shí)間10 s)，同時(shí)皮下注射質(zhì)控菌株以形成潰瘍感染，構(gòu)建多因素誘導(dǎo)的糖尿病性潰瘍模型，結(jié)果顯示該模型可更為真實(shí)地模擬臨床上糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的發(fā)病機(jī)制及多因素下創(chuàng)面潰瘍感染的疾病特征[26-27]。

3 模擬臨床癥狀體征的糖尿病性潰瘍動(dòng)物模型及其分類

模擬臨床癥狀體征的糖尿病性潰瘍動(dòng)物模型主要分為皮膚全層切除模型、燙傷模型等。

3.1 皮膚全層切除模型 腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型后，應(yīng)用外科方法，用18 mm的圓形圖章在距肩胛骨水平下2 cm脊柱正中皮膚上(造模區(qū))印出標(biāo)志，消毒后沿標(biāo)志剪去全層皮膚(深至筋膜)，制備皮膚缺損創(chuàng)面[28-30]。此方法可操作性強(qiáng)、耗時(shí)短，潰瘍形態(tài)規(guī)則且面積可控，適合外用輔料及藥物，以及糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的相關(guān)研究。但該模型無法模擬糖尿病患者因長(zhǎng)期高血糖狀況下導(dǎo)致機(jī)體血管、神經(jīng)、免疫功能等方面發(fā)生病理改變從而引發(fā)潰瘍創(chuàng)面的過程；同時(shí)潰瘍創(chuàng)面持續(xù)時(shí)間較短，若進(jìn)行長(zhǎng)周期的糖尿病性潰瘍創(chuàng)面研究，可運(yùn)用多因素聯(lián)合造模的方法來延長(zhǎng)潰瘍持續(xù)時(shí)間，如聯(lián)合皮下菌株注射合并感染[31]。

3.2 燙傷模型 糖尿病周圍神經(jīng)病變導(dǎo)致肢體末端感覺、溫度覺下降或缺失后，糖尿病患者對(duì)溫度感覺也隨之減弱，因此燙傷成為糖尿病性潰瘍的常見因素之一。有研究應(yīng)用高脂飲食+腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,并于4周后將大鼠股動(dòng)脈及其分支結(jié)扎24 h，使用燙傷模具建造體表燙傷模型，病理結(jié)果顯示大鼠皮膚創(chuàng)面組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴隨汗腺、毛囊等附件破壞，形成深Ⅱ度燙傷，該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血管結(jié)扎結(jié)合燙傷因素造模，更好地模擬了糖尿病性潰瘍創(chuàng)面形成的過程[32]。

4 總結(jié)與展望

高糖高脂飲食結(jié)合STZ誘導(dǎo)法是目前常用的糖尿病動(dòng)物模型建模方法，皮膚全層切除法是常用的糖尿病性潰瘍動(dòng)物模型建模方法。但這些方法仍存在以下問題：(1)對(duì)造模動(dòng)物血糖的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、血糖檢測(cè)時(shí)間、STZ造模所用劑量等，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；(2)造模中急性缺血性壞死的病理改變與糖尿病潰瘍創(chuàng)面中的慢性缺血性病理改變有一定差異；(3)局部壓迫法中缺少可實(shí)時(shí)、客觀監(jiān)測(cè)的血流指標(biāo)；(4)單獨(dú)模擬病理因素或單一模擬臨床癥狀體征，不能完全模擬多種致病機(jī)制，使得動(dòng)物模型的病因癥狀及病理機(jī)制與臨床上的糖尿病性潰瘍?nèi)源嬖谳^大差距。

單獨(dú)模擬病理因素或臨床癥狀體征建立糖尿病性潰瘍動(dòng)物模型相對(duì)簡(jiǎn)易、耗時(shí)較短，其中模擬病理因素的動(dòng)物模型更符合糖尿病性潰瘍的發(fā)病機(jī)制[33]。但臨床上糖尿病性潰瘍主要是由血管損傷、神經(jīng)病變所致，加上潰瘍創(chuàng)面容易反復(fù)感染,在實(shí)驗(yàn)造模上很難完全模擬潰瘍創(chuàng)面發(fā)生的全過程。實(shí)驗(yàn)研究中可以通過多因素聯(lián)合作用來制備糖尿病潰瘍動(dòng)物模型，使造模動(dòng)物的發(fā)病特點(diǎn)及病理機(jī)制等與臨床糖尿病性潰瘍創(chuàng)面更為接近。