黃鑫波 劉端繪 莫旻龍 陳澤宇 明 靜 王勇湘

(廣西梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，梧州市 543002，電子郵箱：stars-002@163.com)

膿毒癥是指感染誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)失衡導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]。目前膿毒癥的致病機(jī)制尚未被完全闡明，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)與代償性抗炎反應(yīng)綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)之間的失衡導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫功能紊亂可加重膿毒癥的病情[2]。既往認(rèn)為膿毒癥患者早期免疫以SIRS為主，后期出現(xiàn)CARS或免疫抑制，但最新的研究顯示在膿毒癥病程中二者并存，共同作用導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡[3-4]。SIRS診斷依據(jù)包含體溫、呼吸頻率、心率、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)四項(xiàng)指標(biāo)[5]，這些指標(biāo)在臨床上容易獲得并且易發(fā)現(xiàn)有無異常，能較為靈敏地反映機(jī)體是否存在炎癥狀態(tài)。T淋巴細(xì)胞與機(jī)體炎癥狀態(tài)、免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，參與SIRS的發(fā)生、發(fā)展過程[6]。目前關(guān)于膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞亞群與炎癥狀態(tài)動(dòng)態(tài)變化的研究仍較少，二者對(duì)于膿毒癥患者預(yù)后的影響仍不明確。本研究探討膿毒癥病程中T淋巴細(xì)胞亞群與炎癥指標(biāo)的水平動(dòng)態(tài)變化，分析兩者的相關(guān)性及對(duì)預(yù)后的影響，為復(fù)雜的膿毒癥免疫治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月至2020年6月我院ICU收治的106例膿毒癥患者作為觀察組，男性65例，女性41例，年齡35～85(62.36±11.19)歲；感染部位：肺部感染51例、顱內(nèi)感染15例、尿路感染18例、膽管感染14例、腸道感染8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合2016年膿毒癥3.0國(guó)際共識(shí)診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；(2)年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在自身免疫性疾病或免疫缺陷性疾病；(2)近6個(gè)月使用過類固醇激素或免疫抑制劑；(3)惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病患者；(4)ICU住院時(shí)間不足24 h者；(5)家屬不愿配合治療者。另選取同期在我院體檢的40例健康志愿者作為對(duì)照組，男性25例，女性15例，年齡39～80(59.16±10.09)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18歲，無嚴(yán)重慢性疾病、無自身免疫病及腫瘤病史，近6個(gè)月無使用類固醇激素或免疫抑制劑史。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，且研究對(duì)象及家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集與檢測(cè)方法：收集健康對(duì)照組體檢當(dāng)天與觀察組患者入院后第1天、第4天、第7天的空腹外周靜脈血T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素水平，以及體溫、呼吸頻率、心率、急性生理與慢性健康評(píng)價(jià)系統(tǒng)Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)評(píng)分。每次均采集血液標(biāo)本6 mL，分成2份，一份于4℃下以1 000 r/min離心10 min，收集血清置于-20℃冰箱中保存待測(cè)；采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)全血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用免疫比濁法檢測(cè)血清CRP水平，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清降鈣素原水平，采用酶促凝集系統(tǒng)透光度測(cè)定法檢測(cè)血清內(nèi)毒素水平。另一份使用Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，采用美國(guó)Beckman公司Navios流式細(xì)胞儀檢測(cè)全血T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平。所有實(shí)驗(yàn)室操作均按照試劑說明書及標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范執(zhí)行。

1.2.2 治療方法：觀察組患者入院后均按《2016年膿毒癥與膿毒癥休克國(guó)際診療指南》[7]進(jìn)行液體復(fù)蘇、抗感染、機(jī)械通氣、血液凈化、營(yíng)養(yǎng)支持、血糖管理、調(diào)控血壓等治療。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組設(shè)計(jì)兩樣本t檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用M(P25，P75)表示，比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson檢驗(yàn)分析T淋巴細(xì)胞亞群與炎癥指標(biāo)、APACHEⅡ評(píng)分的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象觀察指標(biāo)的比較 對(duì)照組患者入院第1天的外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均高于觀察組，而體溫、心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清CRP、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素、外周血CD8+水平均低于觀察組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對(duì)象觀察指標(biāo)的比較

組別n白細(xì)胞計(jì)數(shù)(x±s,×109/L)CRP[M(P25,P75),mg/dL]降鈣素原[M(P25,P75),ng/mL]內(nèi)毒素[M(P25,P75),EU/mL]APACHEⅡ評(píng)分[M(P25,P75),分]觀察組10615.85±7.6713.10(9.10,18.65)17.41(8.19,35.93)0.33(0.04,0.98)24.0(20.00,28.00)對(duì)照組405.84±1.30 0.30(0.10,0.50)0.03(0.01,0.05)0.03(0.02,0.04)3.0(2.00,5.00) t/z值11.820-8.258-8.274-5.762-8.221P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2 不同預(yù)后膿毒癥患者一般資料的比較 根據(jù)觀察組患者入院后28 d的預(yù)后情況分為存活組76例和死亡組30例。存活組患者與死亡組患者的年齡、性別及原發(fā)感染部位比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 存活組與死亡組膿毒癥患者一般資料的比較

2.3 不同預(yù)后膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較 兩組患者的外周血CD4+、CD8+水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=4.643，P組間=0.034；F組間=17.841，P組間<0.001)，但兩組CD4+/CD8+比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=2.918，P組間=0.091)；兩組外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平均有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=8.267，P時(shí)間=0.001；F時(shí)間=6.663，P時(shí)間=0.002；F時(shí)間=3.633，P時(shí)間=0.031)；分組與時(shí)間均有交互效應(yīng)(F交互=5.244，P交互=0.007；F交互=55.415，P交互<0.001；F交互=44.953，P交互<0.001)。其中，入院第7天，存活組的外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均高于死亡組，外周血CD8+水平低于死亡組(均P<0.05)。見表3。

表3 不同預(yù)后膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較

組別nCD4+/CD8+[M(P25,P75)]入院第1天入院第4天入院第7天存活組761.19(0.95,1.76)1.28(0.96,1.72)2.04(1.95,2.27)?死亡組301.29(0.86,1.70)1.17(0.71,2.15)0.86(0.65,1.09)?△

2.4 不同預(yù)后膿毒癥患者炎癥指標(biāo)、生命體征及APACHEⅡ評(píng)分的比較 兩組患者的心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清CRP、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=47.097、11.121、200.266、9.616、36.587、11.238、6.827，P組間<0.001、0.001、<0.001、0.003、<0.001、0.001、0.011)，而兩組的體溫比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=1.129，P組間=0.291)；兩組的心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及血清CRP、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素水平均有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=4.268、5.894、78.765、11.759、12.945、18.874，P時(shí)間=0.017、0.004、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001)，而兩組的體溫及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)均無隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=2.017、2.436，P時(shí)間=0.140、0.094)，分組與時(shí)間均無交互效應(yīng)(F交互=2.724、1.273，P交互=0.072、0.285)。兩組患者心率、APACHEⅡ評(píng)分及血清CRP、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素水平分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(F=12.484、32.352、15.931、4.202、30.058，P<0.001、<0.001、<0.001、0.018、<0.001)，但兩組患者呼吸頻率分組與時(shí)間無交互效應(yīng)(F=0.924，P=0.401)。其中，入院后第4天及第7天，存活組患者的心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清CRP、血清降鈣素原水平均低于死亡組，且入院后第1天存活組心率及APACHEⅡ評(píng)分，以及入院后第7天存活組患者的體溫及血清內(nèi)毒素水平均低于死亡組(均P<0.05)。見表4。

表4 不同預(yù)后膿毒癥患者炎癥指標(biāo)、生命體征及APACHEⅡ評(píng)分的比較

組別n呼吸頻率(x±s,次/min)入院第1天入院第4天入院第7天白細(xì)胞計(jì)數(shù)(x±s,×109/L)入院第1天入院第4天入院第7天存活組7625.44±7.4622.44±4.24?22.94±3.59?15.13±7.5413.25±5.94?12.03±4.11?死亡組3028.50±8.7226.67±4.99△26.27±5.02△17.26±7.8617.05±5.38△16.78±5.83△

組別nCRP(x±s,mg/dL)入院第1天入院第4天入院第7天降鈣素原[M(P25,P75),ng/mL]入院第1天入院第4天入院第7天存活組7613.97±10.258.94±4.32?5.97±3.44?20.64(12.67,29.33)9.64(2.10,15.65)?2.98(0.80,8.21)?死亡組3016.50±5.2716.74±6.97△17.01±5.68△24.78(12.28,46.58)23.47(10.47,37.34)△23.54(13.11,35.44)△

組別n內(nèi)毒素[M(P25,P75),EU/mL]入院第1天入院第4天入院第7天APACHEⅡ評(píng)分(x±s,分)入院第1天入院第4天入院第7天存活組760.26(0.05,0.91)0.11(0.03,0.65)?0.03(0.02,0.10)?22.03±5.5112.69±4.33?7.86±3.46?死亡組300.37(0.04,1.20)0.07(0.02,0.59)?0.23(0.16,1.21)△28.80±7.39△23.63±6.46?△27.83±6.08△

2.5 膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞亞群與炎癥指標(biāo)、APACHEⅡ評(píng)分的相關(guān)性 膿毒癥患者的體溫、心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清CRP、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素水平與外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均呈負(fù)相關(guān)，與外周血CD8+水平呈正相關(guān)(均P<0.05)。見表5。

表5 膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞亞群水平與炎癥指標(biāo)水平、APACHEⅡ評(píng)分的相關(guān)性

3 討 論

膿毒癥免疫失調(diào)的機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為是由于病原微生物感染導(dǎo)致機(jī)體釋放炎癥介質(zhì)誘發(fā)炎癥風(fēng)暴所致。炎癥風(fēng)暴會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多臟器損傷，加重膿毒癥患者免疫功能紊亂，增加死亡率[8]。SIRS的診斷需滿足以下任意2個(gè)或2個(gè)以上條件[5]：(1)體溫>38℃或<36℃；(2)呼吸頻率>20次/min或動(dòng)脈血二氧化碳分壓<32 mmHg；(3)心率>90次/min；(4)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12×109/L或<4×109/L或未成熟中性粒細(xì)胞>10%。Jiang等[9]的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，SIRS嚴(yán)重程度與感染患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。CRP是由肝細(xì)胞分泌的急性時(shí)相蛋白，具有促炎和抗炎特性，CRP水平在感染發(fā)生后4～6 h內(nèi)升高，約2 d達(dá)峰值，隨病情好轉(zhuǎn)而下降[10]。降鈣素原由甲狀腺C細(xì)胞分泌，為一種次級(jí)炎癥介質(zhì)，其并非膿毒癥的啟動(dòng)因子，具有促炎和誘導(dǎo)免疫抑制作用，降鈣素原水平在膿毒癥發(fā)生后2～4 h內(nèi)迅速升高，約6 h達(dá)峰值，隨感染加重而上升，可作為感染早期敏感的生物標(biāo)志物[11-12]。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種脂多糖，是人體極為敏感的“致熱源”，具有明確的致炎性，血液內(nèi)毒素含量達(dá)100 ng即可激活炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響全身臟器功能，當(dāng)機(jī)體發(fā)生革蘭氏陰性菌感染時(shí)內(nèi)毒素大量釋放入血，激活單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子α、一氧化氮、血小板激活因子等炎癥因子，誘發(fā)SIRS導(dǎo)致多臟器功能損傷[13-14]。Klein等[15]研究表明，膿毒癥伴高內(nèi)毒素血癥患者的死亡率和多器官功能障礙發(fā)生率更高。因此，血清內(nèi)毒素可作為感染的炎癥指標(biāo)之一。APACHEⅡ評(píng)分由年齡、急性生理評(píng)分、慢性健康評(píng)分3部分組成，廣泛用于評(píng)估危重患者的病情和預(yù)后，分值越高提示病情越嚴(yán)重、預(yù)后越差。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者入院第1天的外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均低于對(duì)照組，而體溫、心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清CRP、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素、外周血CD8+水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，提示膿毒癥患者早期即存在免疫功能紊亂及全身性炎癥反應(yīng)綜合征。本研究還觀察不同預(yù)后膿毒癥患者的炎性指標(biāo)和APACHEⅡ評(píng)分的變化情況，結(jié)果顯示，存活組經(jīng)治療后心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清CRP、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素水平逐漸下降，與治療第1天比較，治療第7天上述指標(biāo)均明顯改善，治療第7天的體溫與第1天雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但也有所下降；死亡組治療第4天時(shí)，除體溫、血清CRP水平較第1天升高外，心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素水平均較第1天下降好轉(zhuǎn)，但至治療第7天時(shí)各項(xiàng)炎癥指標(biāo)再次升高，且與第1天比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而且治療第7天兩組患者各項(xiàng)炎癥指標(biāo)和APACHEⅡ評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，提示存活組患者經(jīng)治療后高炎癥狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，預(yù)后較好，而死亡組患者仍處于持續(xù)高炎癥反應(yīng)狀態(tài)，預(yù)后不佳。造成兩組患者各項(xiàng)炎癥指標(biāo)變化趨勢(shì)不一致的原因除與兩組病情嚴(yán)重程度不同外，還應(yīng)考慮與主動(dòng)降溫、控制心率、機(jī)械通氣、血液凈化等治療措施有關(guān)。由此推測(cè)，膿毒癥患者全身炎癥反應(yīng)程度重、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)可能與患者預(yù)后不良有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者免疫抑制出現(xiàn)早且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞凋亡、機(jī)體易感性增加，相對(duì)于炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的感染，免疫抑制所致感染的死亡率更高[3-4，16]。T淋巴細(xì)胞是免疫功能的重要指標(biāo)，監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能可評(píng)估膿毒癥患者的預(yù)后[17]。CD4+、CD8+是T淋巴細(xì)胞重要的表面抗原標(biāo)志物，CD4+T淋巴細(xì)胞的主要功能是協(xié)助發(fā)揮體液免疫及細(xì)胞免疫[18]，CD8+T淋巴細(xì)胞則發(fā)揮免疫耐受和細(xì)胞殺傷作用[19]，CD4+T淋巴細(xì)胞增殖或功能不良會(huì)使CD8+T淋巴細(xì)胞輔助能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞殺傷、溶解能力下降，出現(xiàn)免疫抑制[20]。因此，檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+/CD8+能有效地評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，觀察組入院第1天的CD4+T淋巴細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值均低于對(duì)照組，CD8+T淋巴細(xì)胞水平高于對(duì)照組(均P<0.05)，提示膿毒癥患者在發(fā)病早期即存在免疫功能紊亂，出現(xiàn)免疫抑制。進(jìn)一步觀察不同預(yù)后的膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，存活組患者的CD4+T淋巴細(xì)胞水平逐漸升高，CD8+T淋巴細(xì)胞水平先升高后下降，CD4+/CD8+比值先下降后升高，且治療第7天與第1天比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；死亡組患者的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值均先升高后下降，治療第7天與第1天比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；治療第7天，存活組的CD4+、CD4+/CD8+水平均高于死亡組，CD8+水平低于死亡組(均P<0.05)。由此可見，膿毒癥患者免疫功能改善可能預(yù)示預(yù)后良好。本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，膿毒癥患者的體溫、心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評(píng)分及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清CRP、血清降鈣素原、血清內(nèi)毒素水平與外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均呈負(fù)相關(guān)，與外周血CD8+水平均呈正相關(guān)(均P<0.05)，這提示膿毒癥患者同時(shí)存在全身炎癥反應(yīng)與免疫功能紊亂，二者相互影響導(dǎo)致病情加重，改善免疫功能異?？蓽p輕全身炎癥損傷及改善預(yù)后。

綜上所述，膿毒癥患者發(fā)病早期即存在免疫功能紊亂及全身性炎癥反應(yīng)綜合征，兩者共同影響疾病預(yù)后，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群水平及全身炎癥狀態(tài)可評(píng)估膿毒癥患者的臨床診療效果及預(yù)后。但是本研究樣本量小，也沒有進(jìn)一步監(jiān)測(cè)其他炎癥指標(biāo)及淋巴細(xì)胞亞群水平的變化，今后仍需要大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究來論證本研究結(jié)論。