劉 琳，馬騰飛，賈孫悅，周 芹,3,4，王皙瑋,3,4

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，哈爾濱 150080；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱 150080；4農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

紅甜菜是甜菜的一個(gè)變種，又稱為食用甜菜、紫菜頭、牛皮菜等。它具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其根和葉都可食用，根可經(jīng)煮沸、燒烤、腌制后做湯、果醬、果汁、拌沙拉等，葉可作為食品以及菠菜熟食的替代品[1]。據(jù)研究表明[2-3]，紅甜菜還具有良好的抗氧化能力，花青素的存在能有效清除人體內(nèi)的自由基，增強(qiáng)人體的免疫力和抗癌作用，因此食用甜菜在未來(lái)醫(yī)學(xué)保健方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，人們對(duì)于蔬菜及食品中的農(nóng)藥殘留限量檢測(cè)越來(lái)越關(guān)注[4]，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織及有些國(guó)家都制定了相關(guān)的不同農(nóng)藥在不同作物上的農(nóng)藥殘留的最大檢出限量（MRL）[5]規(guī)定，但是國(guó)內(nèi)外對(duì)于紅甜菜，甚至甜菜方面的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)研究都較少[6]，多殘留檢測(cè)更是鮮有報(bào)道，因此建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的農(nóng)藥多殘留聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。農(nóng)藥多殘留檢測(cè)最常用的儀器方法主要有氣相色譜法（GC）[7-8]、液相色譜法（LC）[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法（GC-MS）[10-12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法（LC-MS）[13-14]。其中色譜法主要是針對(duì)某一類農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)，如GC-ECD（電子捕獲檢測(cè)器）[15-16]適用于有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測(cè)，GC-FPD（火焰光度檢測(cè)器）[17]適用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)。電子捕獲檢測(cè)器具有靈敏度高、檢出限低的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于含有較強(qiáng)的電負(fù)性元素的一類物質(zhì)，如F、Cl、O等。有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥分別含有氯元素和氧元素，可以使用電子捕獲檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

前處理是農(nóng)藥殘留檢測(cè)重要環(huán)節(jié)，目前的方法主要包括固相萃取（SPE）[18-19]法 、分散固相萃?。╠-SPE）[20-21]法 、超臨 界 了 流 體 萃 ?。⊿FE）[22-23]法 等 。QuEChERS法（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）于2003年由Anastassiades等提出[24-25]，是基于分散固相萃取法建立起來(lái)的一種快速樣品前處理技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物源食品農(nóng)藥殘留、獸藥殘留的檢測(cè)中。隨著前處理技術(shù)的不斷提升，許多研究者對(duì)傳統(tǒng)QuEChERS方法進(jìn)行了改進(jìn)，大大提升了前處理凈化復(fù)雜基質(zhì)的效果。碳納米管（Carbon nanotubes,CNTs）是碳六元環(huán)構(gòu)成的類石墨平面卷曲而成的納米級(jí)中空管，與GCB、PSA和C18相比具有更大的比表面積、吸附容量和吸附能力，能夠在較短的平衡時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)萃取分離[26-27]。多壁碳納米管（Multiwalled carbon nanotubes,MWCNTs）與單壁碳納米管 （Single walled carbon nanotubes,SWCNTs）相比，吸附性更強(qiáng)，目前已在水樣、農(nóng)藥殘留、獸醫(yī)檢測(cè)多有應(yīng)用[28-31]，但在甜菜農(nóng)藥殘留檢測(cè)中少有報(bào)道。由于紅甜菜基質(zhì)復(fù)雜，前處理凈化尤為重要，本研究采用改良的QuEChERS方法，簡(jiǎn)化了前處理步驟，以多壁碳納米管作為吸附劑，結(jié)合GC-ECD（電子捕獲檢測(cè)器）建立20種有機(jī)氯、擬除蟲菊酯農(nóng)藥在紅甜菜中的檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、成本低，能滿足紅甜菜中一些高毒、難降解農(nóng)藥的檢測(cè)要求，適合在小型實(shí)驗(yàn)室和企業(yè)中推廣使用，對(duì)于保證紅甜菜品質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：島津氣相色譜儀（GC-2010）帶有電子捕獲檢測(cè)器，RTX-1氣相色譜柱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE300；勻漿機(jī)（LB20ES美國(guó)Waring公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器；

試劑：正己烷為色譜純，乙腈、丙酮、NaCl均為分析純，購(gòu)于天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；MWCNTs（直徑大于50 nm，長(zhǎng)度為9.089μm，純度為98%，比表面積為244 m2/g），由山東大島納米材料有限公司提供；Cleanert Florisil固相萃取柱；QuEChERS凈化管（900 mg MgSO4/150 mg PSA）；異狄氏劑、莠去津、溴氰菊酯、順式二氯苯醚菊酯、γ-六六六、氰戊菊酯、pp'-滴滴滴、pp'-滴滴伊、pp'-滴滴涕、op'-滴滴涕、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、δ-六六六、百菌清、β-六六六、艾氏劑、α-六六六、七氯、二氯苯醚菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液均為1000 mg/L，購(gòu)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（天津）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用丙酮稀釋成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。從20種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各取0.1 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，得到1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，置于4℃的冰箱中保存。1.2.2提取 取適量紅甜菜，切碎后準(zhǔn)確稱取25 g于燒杯中，然后加入50 mL的乙腈，置于勻漿機(jī)中勻漿3 min，再轉(zhuǎn)入事先裝有5 g NaCl的具塞量筒中劇烈震蕩，室溫下靜置30 min以上，待有機(jī)相與水相分層，取10 mL上清液于75℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至盡干，加入5 mL正己烷溶解，待凈化。

1.2.3 凈化 取3 mL上述提取液于小燒杯中，加入10 mg多壁碳納米管，震動(dòng)搖勻，用一次性針管取1.5 mL溶液，過0.22μm有機(jī)濾膜后供氣相色譜（GC-2010）測(cè)定。

1.2.4 氣相色譜條件 進(jìn)樣口溫度：220℃；柱箱采用程序升溫：初始150℃，保持2 min，6℃/min升到177.6℃，1℃/min升到 178℃，最后 6℃/min升到 250℃，保留15 min，共34 min；檢測(cè)器（ECD）溫度：300℃；載氣：氮?dú)?，流? mL/min；進(jìn)樣量為5μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的確定

將20種農(nóng)藥混和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，儀器條件為柱箱初始溫度150℃，保留2 min，6℃/min升溫到270℃，保留23 min，在此儀器條件下，發(fā)現(xiàn)γ-六六六與δ-六六六保留時(shí)間過近導(dǎo)致不易分離，后通過不斷地調(diào)整程序升溫條件，在γ-六六六開始出峰時(shí)，以1℃/min的速率進(jìn)行升溫，時(shí)間為0.4 min，最終各種成分達(dá)到有效分離。由于達(dá)到270℃時(shí)導(dǎo)致保留時(shí)間靠后的農(nóng)藥出峰不穩(wěn)，易受雜質(zhì)影響，所以把程序升溫的最終溫度降到了250℃，效果明顯提升。圖1為在上述氣相色譜條件下20種有機(jī)氯、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，目標(biāo)化合物都得到很好的分離。

圖1 20種有機(jī)氯、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的提取溶劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等，不同溶劑對(duì)農(nóng)藥殘留的提取效率有所不同。本研究采用加標(biāo)回收的方法對(duì)比了上述幾種溶劑的提取效果，凈化采用1.2.3步驟方法，得到了不同提取劑與目標(biāo)化合物的回收率關(guān)系圖（圖2）。結(jié)果表明，乙腈對(duì)這20種化合物的提取能力最佳。一般來(lái)說，極性較小的農(nóng)藥可以使用石油醚、正己烷等非極性溶劑或與極性溶劑混合的溶劑提??；極性較強(qiáng)的農(nóng)藥可以用極性溶劑或含水極性溶劑，如丙酮、甲醇等；含水量較多的植物樣品可以用與水能相混溶的極性溶劑，如丙酮、乙腈。紅甜菜含糖較低，水分含量較高，所以本實(shí)驗(yàn)則選取乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同提取劑對(duì)回收率的影響

2.2.2 凈化方法的選擇 紅甜菜含有大量的色素，會(huì)對(duì)農(nóng)藥殘留測(cè)定造成一定干擾，進(jìn)樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化。樣品凈化方法包括固相萃取法、固相微萃取法、膜分離法等等，在諸多的凈化方法中，固相萃取法在農(nóng)藥殘留分析中廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了常規(guī)的固相萃取和分散固相萃取2種凈化方式對(duì)于樣品的凈化效果，參照NY/T 761—2008標(biāo)準(zhǔn)的凈化部分，常規(guī)的固相萃取使用Cleanert Florisil固相萃取柱，QuEChERS凈化管（900 mg MgSO4/150 mg PSA）和MWCNTs作分散固相萃取實(shí)驗(yàn)。比較了3種凈化方式對(duì)于農(nóng)殘回收率的影響。

Cleanert Florisil固相萃取柱含有二氧化硅（84%）、氧化鎂（15.5%）和硫酸鈉（0.5%）等組成成分[32-33]，經(jīng)樣品溶液分離、洗脫后能去除色素、烴類含氮化合物及抗生素等物質(zhì)。QuEChERS凈化管由無(wú)水MgSO4與PSA組合，可以有效去除提取溶液中的水分以及色素等雜質(zhì)。多壁碳納米管內(nèi)徑十分小卻有極高的強(qiáng)度，對(duì)目標(biāo)有機(jī)化合物有極好的吸附能力，少量的吸附劑便可在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到有效凈化分離。

結(jié)果顯示（圖3），固相萃取柱對(duì)雜質(zhì)和農(nóng)藥吸附能力都很強(qiáng)，導(dǎo)致加標(biāo)回收率偏低，而多壁碳納米管在3種吸附劑中整體所獲回收率最高，由色譜圖（圖4）可以看出，采用多壁碳納米管后干擾雜質(zhì)就相對(duì)更少了，具有較好的回收凈化效果。因此，試驗(yàn)選用多壁碳納米管作為前處理的凈化吸附劑。

圖3 不同凈化劑對(duì)農(nóng)藥加標(biāo)回收率的影響

圖4 未凈化空白樣品加標(biāo)農(nóng)藥色譜圖（A）和經(jīng)多壁碳納米管吸附后的空白樣品加標(biāo)農(nóng)藥色譜圖（B）

2.2.3 MWCNTs用量的確定 比較不同MWCNTs的用量（5、10、25、40 mg）對(duì)各農(nóng)藥加標(biāo)凈化效果及回收率的影響。結(jié)果表明（圖5），隨著用量的增加，溶液MWCNTs顏色逐漸加深，進(jìn)樣瓶溶液更為清澈。但是當(dāng)MWCNTs用量大于10 mg時(shí)，20種農(nóng)藥的回收率逐漸降低，因此10 mg用量時(shí)得到的農(nóng)藥回收率最高、凈化效果最好，本試驗(yàn)則選取10 mg為MWCNTs用量。

圖5 MWCNTs的用量對(duì)農(nóng)藥加標(biāo)的回收率的影響

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系與檢出限 在最優(yōu)條件下，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測(cè)，以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/L），對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），采用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)的濃度定義為檢出限（Limit of detection,LOD），10倍的信噪比（S/N=10）對(duì)應(yīng)的濃度定義為定量限（Limit of quantitation,LOQ）。結(jié)果顯示（表1），20種農(nóng)藥在 0.01～0.50 mg/L（莠去津?yàn)?.03～0.50 mg/L）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，LOD為0.12μg/L～0.063 mg/L，LOQ為0.4μg/L～0.21 mg/L。

表1 20種農(nóng)藥的保留時(shí)間、線性關(guān)系、檢出限及定量限

2.3.2 回收率與精密度 在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，對(duì)20種農(nóng)藥在紅甜菜空白樣品中的加標(biāo)回收率進(jìn)行考察。在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下，重復(fù)測(cè)定6次，20種農(nóng)藥的平均回收率在62.0%～116.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為1.9%～10.9%（表2），加標(biāo)回收率和精密度均滿足農(nóng)藥殘留分析相關(guān)要求。

表2 20種農(nóng)藥在紅甜菜中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論與討論

本研究采用改良的QuEChERS法，建立了紅甜菜中20種農(nóng)藥殘留的聯(lián)合測(cè)定方法。樣品采用改良的QuEChERS法進(jìn)行凈化及提取，氣相色譜-ECD進(jìn)行檢測(cè)，20種農(nóng)藥的檢出限及定量限均符合要求。

使用常見有機(jī)溶劑（乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷）進(jìn)行了提取比較試驗(yàn)，根據(jù)20種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率情況，選擇了樣品加標(biāo)回收率最佳的乙腈作為提取溶劑。由于氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器的檢測(cè)限較低、靈敏度較高，容易出現(xiàn)目標(biāo)峰外的干擾雜質(zhì)，因此對(duì)于實(shí)驗(yàn)前處理?xiàng)l件要求較高。QuEChERS法在許多研究中都有成功案例[34-35]，本試驗(yàn)在QuEChERS法原理的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，選取Cleanert Florisil固相萃取柱、QuEChERS 凈化管（900 mg MgSO4/150 mg PSA）和MWCNTs 3種凈化方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MWCNTs具有較強(qiáng)的吸附、凈化能力，并在20種有機(jī)氯、擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留的空白加標(biāo)樣品中都能夠得到較高的回收率，所以最終選擇多壁碳納米管作為QuEChERS法的吸附劑。試驗(yàn)簡(jiǎn)化了前處理凈化步驟并結(jié)合多壁碳納米管作為吸附劑，得到了改進(jìn)的QuEChERS分析方法，較傳統(tǒng)方法而言具有簡(jiǎn)單、快捷、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

根據(jù)GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[36]的相關(guān)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，研究建立了氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定紅甜菜中20種有機(jī)氯、擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留的方法，對(duì)儀器參數(shù)和樣品前處理都進(jìn)行了一定的優(yōu)化。本檢測(cè)方法對(duì)紅甜菜樣品進(jìn)行了低、中、高3個(gè)水平濃度的農(nóng)藥添加，所測(cè)的目標(biāo)化合物在0.01～0.50 mg/L（莠去津?yàn)?.03～0.50 mg/L）范圍內(nèi)呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，平均回收率在62.0%～116.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）在1.9%～10.9%之間。該方法充分滿足了紅甜菜中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類多農(nóng)藥殘留測(cè)定的要求，具有簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可大力推廣于中、小型實(shí)驗(yàn)室中。