汪 曼，周婉婷，周 翔，李思琪，王雪倩，王錄紅，李王勝，李佳佳，高 卓,3，劉大麗

（1國(guó)家甜菜種質(zhì)中期庫(kù)，黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；2省高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；3黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

隨著工業(yè)化進(jìn)程的加速，中國(guó)已成為全球土壤污染最嚴(yán)重的國(guó)家之一。工業(yè)排放、污水灌溉、化肥農(nóng)藥的不合理施用及大氣沉降等原因已造成不同程度的土壤重金屬污染[1]。中國(guó)每年因重金屬污染土壤而導(dǎo)致的糧食減產(chǎn)達(dá)1000萬(wàn)t以上[2]，其中重金屬鎘（Cd）污染居所有污染物的首位[3]。因此圍繞Cd元素展開(kāi)土壤修復(fù)探討比較具有代表性，生物技術(shù)治理作為一種土壤修復(fù)領(lǐng)域中的新型治理措施，正在被廣泛推廣并運(yùn)用，而這其中目前最具實(shí)踐意義的是植物修復(fù)[4]。

能源甜菜（Beta vulgarisL.）因其非生物脅迫適應(yīng)能力強(qiáng)，生物學(xué)產(chǎn)量高，乙醇轉(zhuǎn)化率高，是新興的可再生能源作物，在重金屬污染土壤的修復(fù)中表現(xiàn)出了極大的潛力，是植物修復(fù)的優(yōu)良目標(biāo)物種[5]。而植物修復(fù)這一系列復(fù)雜的生理生化過(guò)程中就涉及到了轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[6]。轉(zhuǎn)錄因子是真核生物體內(nèi)一大類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠通過(guò)特異性結(jié)合相關(guān)順式作用元件來(lái)激活或抑制下游相關(guān)基因的表達(dá)[7]。植物基因組比其他真核生物基因組包含更多的轉(zhuǎn)錄因子，其中bZIP、WRKY、AP2/ERF和MYB轉(zhuǎn)錄因子與抗逆反應(yīng)密切相關(guān)，在植物基因的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)中一直備受關(guān)注[8]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，已被證明在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫反應(yīng)中有重要調(diào)控作用[9]。MYB轉(zhuǎn)錄因子由高度保守的MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域定義，一般位于N末端，MYB結(jié)構(gòu)域中分別具有1、2、3和4個(gè)肽重復(fù)序列，根據(jù)其相鄰不完全重復(fù)序列的數(shù)量，MYB轉(zhuǎn)錄因子被分為4個(gè)亞家族 ，分別為 MYB-related（1R-MYB）、R2R3-MYB（2RMYB）、R1R2R3-MYB（3R-MYB）和4R-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞家族[10-11]。MYB轉(zhuǎn)錄因子最初于1982年在禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）中被發(fā)現(xiàn)，并被命名為“v-MYB”[12]。5年后，第一個(gè)被成功克隆的MYB基因?yàn)橛衩祝╖ea maysL.）中色素合成相關(guān)基因ZmMYBC1[13]。迄今為止已在多種植物中發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，其中在模式植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有339個(gè)MYB家族的成員，水稻（Oryza sativaL.）中已發(fā)現(xiàn)有230個(gè)[14-15]。

目前關(guān)于MYB轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫反應(yīng)的研究大多集中在干旱脅迫、鹽脅迫、溫度脅迫以及磷脅迫[16-18]，而關(guān)于重金屬脅迫的報(bào)道相對(duì)較少。甜菜中共篩選出79個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中42個(gè)在干旱脅迫下差異表達(dá)；70個(gè)為R2R3-MYB基因，其中BvMYB12為第一個(gè)具有實(shí)驗(yàn)證明功能的甜菜R2R3-MYB，編碼黃酮醇調(diào)節(jié)因子[19-20]?？偟膩?lái)說(shuō)甜菜中MYB基因的相關(guān)功能研究鮮有報(bào)道，且未見(jiàn)其參與重金屬脅迫的相關(guān)研究。

本研究中的能源甜菜轉(zhuǎn)錄因子BvMYB44基因是在本課題組前期鎘脅迫轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜研究中得到的差異表達(dá)基因，且表達(dá)極為顯著，推測(cè)其在重金屬脅迫中發(fā)揮著重要作用。因此本研究對(duì)能源甜菜轉(zhuǎn)錄因子BvMYB44進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)來(lái)探究轉(zhuǎn)錄因子BvMYB44基因響應(yīng)重金屬鎘脅迫的表達(dá)特性，為進(jìn)一步解析轉(zhuǎn)錄因子BvMYB44基因在能源甜菜重金屬脅迫中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為抗重金屬能源甜菜的種質(zhì)創(chuàng)新以及拓展植物修復(fù)提供候選基因和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 能源甜菜BvMYB44基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的ORF Finder在線分析BvMYB44基因的開(kāi)放閱讀框和編碼的氨基酸。利用GSDS2.0分析該基因外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。利用ProtParam tool分析該蛋白的分子量、等電點(diǎn)相關(guān)理化性質(zhì)。通過(guò)ProtScale來(lái)預(yù)測(cè)該蛋白的親/疏水性。通過(guò)SignalP-5.0 Server預(yù)測(cè)該蛋白信號(hào)肽的位置。利用TMpred分析該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。利用SOPMA在線預(yù)測(cè)分析BvMYB44蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用SMART在線工具對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用MEME軟件對(duì)該蛋白的保守位點(diǎn)進(jìn)行分析。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTP獲得與BvMYB44氨基酸序列同源性較高的不同物種，用DNAMAN8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA7軟件的最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1000次。利用NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)該蛋白的磷酸化位點(diǎn)。利用BaCelLo對(duì)BvMYB44蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用PlantCARE在線工具分析該基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件。

1.2 時(shí)間與地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2020年10月—2021年4月，在黑龍江大學(xué)省高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)施并完成。

1.3 材料與處理

植物材料能源甜菜種子‘780016B/12優(yōu)’由國(guó)家甜菜種質(zhì)資源中期庫(kù)（國(guó)家甜菜種質(zhì)資源平臺(tái)）提供使用。將能源甜菜種子‘780016B/12優(yōu)’在培養(yǎng)室內(nèi)，用14 h光照25℃，10 h黑暗18℃條件培養(yǎng)，四周后用CdCl2進(jìn)行鎘脅迫處理。鎘脅迫濃度為0.5 mmol/L，分別于0、6、12、24、48 h收集鎘脅迫下的葉和根組織，液氮冷凍后置于-80℃冰箱備用。

1.4 總RNA的提取

將上述鎘脅迫處理的甜菜葉和根組織用EasyPure Plant RNA Kit（TransGen）試劑盒進(jìn)行總 RNA的提取，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA的質(zhì)量，并通過(guò)超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。

1.5 反轉(zhuǎn)錄cDNA

根據(jù)TransStart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，取適量總RNA進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。將42℃孵育30 min的合成產(chǎn)物cDNA置于-20℃冰箱備用。

1.6 能源甜菜BvMYB44響應(yīng)鎘脅迫的表達(dá)分析

根據(jù)BvMYB44序列，利用NCBI的Primer-BLAST在線工具設(shè)計(jì)特異性的熒光定量PCR引物（F：5’-ACC GGAAAGAAG TGGACC GGATAAA-3’，R：5’-AAT CAA AGA CCA GTT TCT TGG GCC G-3’）。以BvGAPDH為內(nèi)參基因（F：5’-GCT TTG AAC GAC CAC TTC GC-3’，R：5’-ACG CCG AGA GCA ACT TGA AC-3’）。 以 SYBR Green 為 標(biāo) 記 物 ，采 用SuperReal PreMix Plus（TIANGEN）試劑盒進(jìn)行 qRTPCR表達(dá)分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含 SuperReal PreMix Plus（2×）10 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、正反向引物（10 μmol/L）各 0.6 μL、cDNA模板1 μL、RNase-free ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增兩步法反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，60℃退火/延伸32 s，40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。利用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)熒光定量PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用 2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，用Microsoft Excel軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 BvMYB44基因結(jié)構(gòu)特征分析

ORF Finder分析結(jié)果顯示，BvMYB44基因cDNA全長(zhǎng)為942 bp，共編碼313個(gè)氨基酸。為了解BvMYB44基因的結(jié)構(gòu)特征，用GSDS2.0確定了BvMYB44基因外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量和位置。結(jié)果顯示（圖1），BvMYB44外顯子數(shù)量為1，且不含有內(nèi)含子，符合先前報(bào)道的MYB結(jié)構(gòu)域編碼序列中一般含有0～2個(gè)內(nèi)含子的特征。

圖1 BvMYB44基因結(jié)構(gòu)特征分析

2.2 BvMYB44蛋白的理化性質(zhì)分析

ProtParamtool在線軟件分析BvMYB44蛋白分子式為C1450H2295N435O467S20；BvMYB44分子量為33935.01 Da；理論等電點(diǎn)（Theoretical Pi）為7.57，數(shù)值大于7，推測(cè)其為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為51.28，數(shù)值大于40，推測(cè)其為不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為62.68；平均親/疏水系數(shù)為-0.576，推測(cè)其為親水蛋白。

2.3 BvMYB44蛋白親/疏水性、信號(hào)肽的預(yù)測(cè)以及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

用ProtScale分析親/疏水性顯示（圖2），BvMYB44蛋白氨基酸位點(diǎn)親水性在第167位最強(qiáng)，數(shù)值為-3.289；在第231位疏水性最強(qiáng)，數(shù)值為1.400，且整體親水性位點(diǎn)多于疏水性位點(diǎn)，因此親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白為親水蛋白，同時(shí)這與ProtParam tool分析結(jié)果一致。同時(shí)，預(yù)測(cè)分析表明BvMYB44蛋白無(wú)信號(hào)肽。且該蛋白不存在跨膜區(qū)域。

圖2 BvMYB44蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)

2.4 BvMYB44蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

SOPMA預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，BvMYB44蛋白的組成包含27.16%的α-螺旋，4.79%的延伸鏈，3.51%的β-轉(zhuǎn)角和64.54%的無(wú)規(guī)卷曲，因此α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要元件（圖3）。

圖3 BvMYB44蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

如圖4所示，使用SWISS-MOLD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)BvMYB44蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行同源性3D建模，根據(jù)評(píng)分選擇最佳模型，序列同源性為56.73%，數(shù)值大于40%，模型可信度高。3D模型顯示該蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成，與SOPMA預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致，且具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）結(jié)構(gòu)，符合MYB結(jié)構(gòu)特征。

圖4 BvMYB44蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 BvMYB44蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

SMART分析BvMYB44蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示其包含2個(gè)重復(fù)的MYB的DNA保守結(jié)構(gòu)域SANT，這2個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域分別位于第21～70位和第73～121位氨基酸處，符合典型的MYB家族基因結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，推測(cè)其屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員（圖5）。

圖5 BvMYB44蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.6 BvMYB44蛋白保守位點(diǎn)分析

為進(jìn)一步了解BvMYB44蛋白保守結(jié)構(gòu)域的具體特征，通過(guò)MEME分析其保守位點(diǎn)。字母越高即代表該位點(diǎn)上氨基酸殘基出現(xiàn)的概率越大，保守程度也就越高。如圖6所示，高度保守的色氨酸（W）殘基作為植物MYB蛋白的標(biāo)志，在R2、R3基序中有一定規(guī)律的間隔分布形成疏水中心。除色氨酸殘基外圖中還包含其他保守的氨基酸殘基，它們極有可能共同維持了R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的HTH結(jié)構(gòu)，在序列特異性的DNA結(jié)合中起著關(guān)鍵作用，以保證蛋白能夠正確折疊從而行使功能。

圖6 BvMYB44蛋白保守位點(diǎn)分析

2.7 BvMYB44蛋白的多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTP獲得與能源甜菜BvMYB44氨基酸序列同源性較高的其他不同物種，藜麥（Chenopodium quinoa）、菠菜（Spinacia oleracea）、葡萄（Vitis riparia）、相思子（Abrus precatorius）、野生大豆（Glycine soja）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、川桑（Morus notabilis）、栓 皮 櫟 （Quercus suber）、蔓 花 生（Arachis duranensis）、豇豆（Vigna unguiculata），將以上物種序列和能源甜菜BvMYB44一起用DNAMAN8進(jìn)行多序列比對(duì)，并用MEGA7軟件的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

比對(duì)結(jié)果表明（圖7），BvMYB44蛋白的MYB結(jié)構(gòu)域位于N末端，序列保持高度一致，且含有R2、R3不完全重復(fù)序列，不完全重復(fù)序列間每隔約18個(gè)氨基酸殘基由1個(gè)色氨酸殘基間隔開(kāi)來(lái)。而C端序列相似性較低，這有利于該區(qū)域轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的行使。進(jìn)化結(jié)果顯示（圖8），系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)整體分支絕大多數(shù)數(shù)值大于70%，表明構(gòu)建的該進(jìn)化樹(shù)可信，其中與能源甜菜BvMYB44進(jìn)化關(guān)系最近的是藜麥CqMYB44-like和菠菜SoMYB44-like且同源性高。

圖7 BvMYB44與其他MYB類同源蛋白多序列比對(duì)

圖8 BvMYB44和其他植物MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

2.8 BvMYB44蛋白的磷酸化位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

NetPhos 3.1 Server磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)BvMYB44結(jié)果表明，該蛋白共有39個(gè)磷酸化位點(diǎn)，32個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

為研究BvMYB44轉(zhuǎn)錄因子的功能機(jī)制，利用BaCelLo預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位，定位結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞核中，這有利于BvMYB44在細(xì)胞核內(nèi)行使其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。

2.9 BvMYB44基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

為探究BvMYB44基因的調(diào)控機(jī)制，通過(guò)NCBI獲取該基因起始密碼子上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，通過(guò)PlantCARE來(lái)預(yù)測(cè)其順式作用元件。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（表1）該區(qū)域中含有53個(gè)CAAT-box和51個(gè)TATA-box啟動(dòng)子區(qū)基本組成元件，說(shuō)明該區(qū)域是典型的真核生物核心啟動(dòng)子區(qū)，且該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性較高。

表1 BvMYB44基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

在BvMYB44啟動(dòng)子序列中，發(fā)現(xiàn)了許多應(yīng)激誘導(dǎo)元件，包括ABRE（脫落酸響應(yīng)元件）、CGTCA-motif（茉莉酸甲酯響應(yīng)元件）、ERE（乙烯響應(yīng)元件）、MYB（干旱響應(yīng)元件）、MYC（缺水、抗脫落酸、抗凍、抗寒響應(yīng)元件）、P-box（赤霉素響應(yīng)元件）、STRE（脅迫響應(yīng)元件）、TATC-box（赤霉素響應(yīng)元件）、TGACG-motif（茉莉酸甲酯響應(yīng)元件）、W box（防御和脅迫響應(yīng)元件）、WUN-motif（傷害響應(yīng)元件）、as-1（傷害、赤霉素、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件）。這些結(jié)果表明，BvMYB44的轉(zhuǎn)錄可能是由激素脅迫和非生物脅迫誘導(dǎo)的。

2.10 BvMYB44基因響應(yīng)鎘脅迫的表達(dá)分析

為進(jìn)一步探究BvMYB44基因應(yīng)對(duì)非生物鎘脅迫的響應(yīng)，對(duì)能源甜菜幼苗用0.5 mmol/L濃度的CdCl2進(jìn)行鎘脅迫處理，選取0、6、12、24、48 h的葉和根材料進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。熒光定量PCR結(jié)果表明，與未進(jìn)行鎘脅迫處理的對(duì)照相比，在鎘脅迫處理下，葉和根中BvMYB44基因的表達(dá)量均上調(diào)，隨著鎘脅迫處理時(shí)間的增加，BvMYB44基因的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)（圖9）。

圖9 BvMYB44基因在鎘脅迫處理下葉和根的相對(duì)表達(dá)量

在能源甜菜葉組織中，當(dāng)鎘脅迫處理時(shí)間為6 h和24 h時(shí)，BvMYB44基因的相對(duì)表達(dá)量上升極為顯著，在24 h時(shí)達(dá)到最大相對(duì)表達(dá)量10.34，處理時(shí)間為12 h和48 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量雖相比對(duì)照上升但差異不顯著。在能源甜菜根組織中，當(dāng)鎘脅迫處理時(shí)間為6 h和12 h時(shí)，BvMYB44基因的相對(duì)表達(dá)量上升極為顯著，在12 h時(shí)達(dá)到最大相對(duì)表達(dá)量5.81，處理時(shí)間為24 h和48 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量上升差異不顯著。從整體來(lái)看，除鎘脅迫處理時(shí)間為12 h時(shí)，BvMYB44基因在根組織中的相對(duì)表達(dá)量大于葉組織外，在鎘脅迫處理時(shí)間為6 h、24 h和48 h時(shí)，BvMYB44基因在葉組織中的相對(duì)表達(dá)量均大于根組織。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明BvMYB44基因的表達(dá)量受鎘脅迫的響應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

從《2015研究前沿》報(bào)告中可以看出，近年來(lái)機(jī)制性研究正在逐步深入，從基本的功能基因的研究向調(diào)控因子上過(guò)渡[21]。本研究轉(zhuǎn)錄因子BvMYB44基因?qū)︽k脅迫的響應(yīng)，首次證實(shí)了調(diào)控因子在能源甜菜應(yīng)對(duì)重金屬逆境脅迫的重要作用，為能源甜菜在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面的功能研究提供了理論基礎(chǔ)，也為抗重金屬能源甜菜作為植物修復(fù)優(yōu)良目標(biāo)物種的種質(zhì)創(chuàng)新提供了基因資源。

在被子植物中，R2R3-MYB家族基因作為MYB類轉(zhuǎn)錄因子最大的亞家族，該亞家族的大量擴(kuò)展被認(rèn)為是因?yàn)橹参餅榈钟h(huán)境變化而進(jìn)化復(fù)雜性的增加有關(guān)[20]。因此R2R3-MYB亞家族可能參與了植物的特異性調(diào)節(jié)過(guò)程，涉及到生長(zhǎng)發(fā)育、初次生代謝、應(yīng)答生物和非生物脅迫反應(yīng)等[10,22]，如小麥、玉米、水稻、擬南芥中大量的R2R3-MYB成員直接或間接參與了非生物脅迫響應(yīng)途徑[15,23]。AtMYB44通過(guò)調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉以響應(yīng)非生物脅迫，NtMYB44b也參與響應(yīng)多種激素誘導(dǎo)和干旱脅迫[24]。本研究顯示BvMYB44也屬于R2R3-MYB亞家族成員，其應(yīng)對(duì)非生物逆境鎘脅迫的響應(yīng)情況符合該家族典型的功能特性。

BvMYB44蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該蛋白富含α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，含有MYB蛋白的標(biāo)志結(jié)構(gòu)HTH結(jié)構(gòu)[20,24]，保守位點(diǎn)分析也推測(cè)出高度保守的色氨酸殘基和其他氨基酸殘基共同維持了該結(jié)構(gòu)的形成，有利于BvMYB44蛋白功能的行使。磷酸化與蛋白質(zhì)活性變化密切相關(guān)，BvMYB44轉(zhuǎn)錄因子共含有39個(gè)磷酸化位點(diǎn)，表示該蛋白的調(diào)控方式可能由多種翻譯后修飾表達(dá)的蛋白參與作用，使BvMYB44轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控響應(yīng)多種環(huán)境脅迫。多序列比對(duì)表明多種不同物種中的MYB轉(zhuǎn)錄因子具有較高保守性，與BvMYB44進(jìn)化關(guān)系最近的是藜麥和菠菜且相似度高，SoMYBs有R2R3-MYB成員被分析可能參與非生物脅迫[25]，據(jù)此推測(cè)BvMYB44在進(jìn)化過(guò)程中功能相對(duì)保守。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)BvMYB44轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中，大多數(shù)研究顯示轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核，或定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[18,26]，該預(yù)測(cè)符合轉(zhuǎn)錄因子的典型特征，有助于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的行使，后續(xù)可通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的具體定位。

啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的預(yù)測(cè)為基因的進(jìn)一步功能分析提供了基礎(chǔ)[27]，本研究在BvMYB44基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了脫落酸、茉莉酸甲酯、乙烯、赤霉素多種激素相關(guān)元件和MYB、MYC、P-box、STRE、W box、WUN-motif、as-1應(yīng)激誘導(dǎo)元件。以上順式作用元件被證明與脅迫反應(yīng)密切相關(guān)，除防御和脅迫響應(yīng)元件外，赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯也被證明在非生物脅迫中發(fā)揮作用[28-29]。這表明BvMYB44轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)調(diào)節(jié)激素和應(yīng)激誘導(dǎo)來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路參與非生物脅迫，后續(xù)可通過(guò)進(jìn)一步研究BvMYB44特定結(jié)合基序探究其結(jié)合活性和調(diào)控機(jī)制。

前人研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠被鎘脅迫顯著誘導(dǎo)。SbMYB15在重金屬鎘和鎳脅迫處理下上調(diào)表達(dá)，其異源過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗重金屬脅迫的能力[30]。鎘脅迫反應(yīng)中，BnMYB2的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)該基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的鎘的耐受性和積累[31]。本研究檢測(cè)了BvMYB44基因在響應(yīng)鎘脅迫下的相對(duì)表達(dá)量，該表達(dá)模式顯示了轉(zhuǎn)錄因子BvMYB44基因在應(yīng)激反應(yīng)中的積極作用，同時(shí)也揭示了BvMYB44可能在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的防御作用中發(fā)揮著重要作用，但其所介導(dǎo)的一系列調(diào)控機(jī)制還有待后續(xù)的進(jìn)一步研究。

總之，MYB轉(zhuǎn)錄因子雖已在多種植物中得以廣泛研究，已被證明響應(yīng)非生物脅迫反應(yīng)，如干旱脅迫、鹽脅迫和高溫脅迫為主要研究對(duì)象，但對(duì)重金屬脅迫相關(guān)的功能探究相對(duì)較少，且目前其在能源甜菜中的功能研究鮮有報(bào)道。本研究中BvMYB44基因全長(zhǎng)942 bp，編碼313個(gè)氨基酸，屬R2R3-MYB亞家族，定位于細(xì)胞核，啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)到多個(gè)應(yīng)激誘導(dǎo)元件，qRT-PCR揭示其響應(yīng)鎘脅迫逆境，為鎘脅迫的積極響應(yīng)提供了一些理論基礎(chǔ)，可作為能源甜菜鎘逆境候選基因進(jìn)行深入研究。