田京歌，馮有龍

（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，江蘇南京 210019）

泛酸又稱遍多酸或維生素B5，是一種水溶性維生素，是輔酶A和?；d體蛋白生物合成的重要前體物質(zhì)，參與生物體內(nèi)碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)和能量代謝，但游離泛酸對熱、酸和堿均不穩(wěn)定[1-2]，因此工業(yè)應用通常使用穩(wěn)定性好的衍生物——泛酸鈣。泛酸鈣通常作為一種營養(yǎng)強化劑添加于多種食品和保健食品中，以補充泛酸攝入的缺失，保證人體正常的新陳代謝，保健食品作為一種特殊的食品，越來越引起人們的重視。

測量不確定度可以合理的表征測量結(jié)果的范圍區(qū)間，并關(guān)系著合格結(jié)論的判定，可以更好地評價測量結(jié)果的準確度[3-5]。泛酸鈣作為一種重要的營養(yǎng)補充劑，準確測定其含量可以更好地評價保健食品的質(zhì)量。目前文獻報道多是關(guān)于食品中泛酸含量測定的不確定度評定[6-7]，未見有保健食品中泛酸鈣含量測定的不確定度評定。本文參考《保健食品中泛酸鈣的測定》（GB/T 22246—2008）[8]，采用高效液相的方法測定了生命力牌多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣的含量，為了評價泛酸鈣測定結(jié)果的準確度，提高檢測水平，本試驗依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）和 CNAS-CL006：2019 化學分析中不確定度的評估指南程序?qū)Σ淮_定度來源進行了分析[9-10]，參考相關(guān)文獻[11-12]，計算不確定度各分量，并合成結(jié)果，以此來評價各個因素對測定結(jié)果的影響，進而提高檢測水平，控制檢測質(zhì)量，同時為其他相關(guān)不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泛酸鈣（批號100370-201903，質(zhì)量分數(shù)96.8%）來源于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，Merck公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團有限公司）；磷酸（色譜純，阿拉丁公司）；水為去離子水（經(jīng)Milli-Q水處理系統(tǒng)得到）；生命力牌多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院提供）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260，DAD檢測器）；超聲波清洗器（型號為KH-250DB，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；電子天平（型號CPA224S，賽多利斯）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ACE 5 Excel 5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0）-乙腈=95∶5；檢測波長為200 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

1.3.2 溶液的制備

（1）對照品標準儲備液的制備。稱量泛酸鈣標準品約0.1 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻。

（2）對照品標準使用液的制備。精密量取泛酸鈣儲備液5 mL置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

（3）標準曲線的制備。吸取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL和8.00 mL泛酸鈣標準使用液（相當于 2.5 μg、5.0 μg、10.0 μg、20.0 μg、40.0 μg和80.0 μg泛酸鈣），分別置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。在給定的儀器條件下，進行色譜分析，以峰面積對濃度作標準曲線。

（4）供試品溶液的制備。稱取0.3 g粉碎后的均勻試樣（精確到0.001 g），使試樣濃度位于標準曲線中。試樣置于25 mL容量瓶中，加水20 mL，超聲處理20 min后，加水至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得。

1.3.3 數(shù)學模型的建立

試樣中泛酸鈣的含量計算如下：

式中：X-試樣中泛酸鈣的含量，單位為g/100 g；C-由標準曲線求得進樣液中泛酸鈣的濃度，單位為μg/mL；V-試樣定容體積，單位為mL；m-試樣的質(zhì)量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)檢測過程和數(shù)學模型分析，泛酸鈣含量測定相對標準不確定度ur（X）的來源主要有以下幾個方面，具體見圖1。其不確定度的來源包括：供試品的稱量引入的相對標準不確定度ur（Mt）、供試品的定容體積引入的相對標準不確定度ur（Vt）、供試品的重復測定引入的相對標準不確定度ur（Rp）、方法回收率引入的相對標準不確定度ur（Rc）、供試品溶液的濃度引入的相對標準不確定度ur（C），其中ur（C）來源于對照品儲備溶液的制備過程、對照品標準溶液制備過程、標準曲線因素等。

圖1 不確定度來源分析圖

2.2 不確定度評定

2.2.1 供試品的稱量引入的相對標準不確定度u（rMt）

CPA224S型天平為萬分之一天平（d=0.1 mg），檢定證書的最大允差為±0.000 5，按照矩形分布，k=，稱取供試品2份，減重法稱重，2次的稱樣量分別為0.305 1 g，0.302 4 g。則稱樣量的相對標準不確定度為則供試品稱量引入的相對標準不確定度為ur（Mt）=

2.2.2 供試品的定容體積引入的相對不確定度ur（Vt）

本次試驗中所用的玻璃儀器的容量允許誤差引入的不確定度均按B類不確定度進行評定，容量瓶的體積變化相對液體可以忽略，只考慮液體的膨脹引入的不確定度，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，實驗室溫度控制在（20±5） ℃，服從矩形分布，則環(huán)境溫度變化引入的相對標準不確定度為試驗采用25 mL的容量瓶，由國家計量檢定規(guī)程JJG 196—2006[13]查得其容量允差±0.030 mL，則其引入的相對標準不確定度為則

2.2.3 供試品的重復測定引入的相對標準不確定度u（rRp）

在檢測過程中，測量重復性引入的不確定度包括了各種隨機因素，如人員實驗操作熟練程度、儀器性能等，該不確定度屬于A類不確定度，平行制備12份供試品溶液，按照“1.3.1”項下的色譜條件進行12次測定，泛酸鈣的含量分別為0.297 g/100 g、0.285 g/100 g、0.301 g/100 g、0.308 g/100 g、0.308 g/100 g、0.287 g/100 g、0.298 g/100 g、0.300 g/100 g、0.292 g/100 g、0.302 g/100 g、0.287 g/100 g和 0.291 g/100 g，測得重復測量（n=12）的平均值為=0.296 g/100 g，標準偏差SD（Rp）=0.007 935，則重復測量產(chǎn)生的相對不確定度為

2.2.4 方法回收率引入的相對標準不確定度ur（Rc）

按照低、中、高3種濃度水平（m=3）進行加樣回收試驗，使待測樣品量與加入對照品的量比例分別為1.0∶1.0、1.0∶0.5、1.0∶1.5，每種濃度制備3份供試品，計算方法回收率，結(jié)果分別為94.8%、93.7%、95.2%、95.4%、96.5%、93.7%、94.8%、98.2%和92.3%，方法回收率不確定度屬于A類不確定度，平均回收率標準偏差SD（Rc）為1.71%，則回收率的相對標準不確定度為采用t檢驗的方法來分析方法平均回收率與回收率100%之間是否有顯著性差異，以此判斷是否需要用回收率對計算結(jié)果進行修正，而在自由度為8，置信概率為95%下，t0.95（8）=2.31，因t＞2.31，故本試驗中需要用回收率來修正計算結(jié)果，則供試樣品中泛酸鈣的實際含量

2.2.5 供試品溶液的濃度引入的相對標準不確定度ur（C）

（1）對照品儲備溶液的濃度引入的相對標準不確定度ur（C0）。對照品儲備溶液濃度的標準不確定度由對照品純度和稱量等因素引入。泛酸鈣對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，說明書中對照品純度為96.8%，未注明不確定度值，暫假設其純度為96.8%±0.05%，服從矩形分布（），則對照品純度引入的相對標準不確定度為

對照品稱量引入的不確定度由天平的最大允差計算，采用的為萬分之一天平（d=0.1 mg），檢定證書的最大允差為±0.000 5，按照矩形分布采用減重法稱重，稱取對照品量為0.101 6 g，故天平稱重引入的相對標準不確定度為

對照品儲備液配制過程中使用的是100 mL的容量瓶，其為A級，查得其容量允差為±0.10 mL，按矩形分布，則玻璃器皿引入的相對標準不確定度為因環(huán)境溫度變化而引入的相對標準不確定度為合成對照品儲備液配制過程引入的相對標準不確定度為

將上述不確定度分量合成，得到對照品儲備溶液的濃度引入的相對標準不確定度為ur（C0）=

（2）標準溶液的配制過程引入的相對標準不確定度ur（V0）。本試驗中由對照品儲備液配制對照品工作溶液，之后配制成標曲系列濃度，均會采用玻璃量具，包含刻度吸管、容量瓶等，按照國家計量檢定規(guī)程的要求，都有相應的允差，按照矩形分布計算，k=，由此來計算所采用的玻璃器皿的相對標準不確定度分量，具體見表1。

表1 玻璃器皿引入的不確定度

則標曲各溶液配制過程中引入的相對標準不確定度為

（3）標準曲線的擬合引入的相對標準不確定度ur（C1）。本試驗中系列標準溶液按1.3.1色譜條件分別測定1次，結(jié)果見表2。

表2 標曲溶液測定結(jié)果

其 中， 斜 率a=13.693 5， 截 距b=1.851 3，則擬合標準曲線峰面積A殘差的標準偏差為為測定次數(shù)，n=6。

對供試品溶液重復測定12次，p=12，計算得到供試品中泛酸鈣的含量為則ur(C1)為：

將以上不確定度分量合成得到ur（C）

2.3 合成不確定度及擴展不確定度

綜上分析，本試驗中高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定生命力牌多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣含量的各相對標準不確定度分量見表3。

表3 相對標準不確定度

將上述不確定度合成得到合成相對標準不確定度為

本試驗中測得供試品中泛酸鈣的實際含量為Xt=0.312 g/100 g，合成標準不確定度為：

取包含因子為k=2，置信概率為95%，則擴展不確定度為：U=2×Uh(X1) =2×0.004 671=0.0093 g/100 g，因此，HPLC法測定生命力牌多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣含量的結(jié)果可表示為：（0.312±0.009 3） g/100 g，k=2（95% 的置信區(qū)間）。

3 結(jié)論與討論

本文對采用HPLC法測定保健食品多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣的含量進行了不確定度評定，通過計算各個相對標準不確定度，可以推測得出試驗中不確定度的來源主要是標曲溶液的配制，其次是樣品測定的重復性，方法回收率及對照品儲備溶液濃度的影響，最后是標準曲線的擬合及供試品稱量及定容體積的影響。因此，在以后的試驗測定中要加強對以上影響因素的控制，改進試驗方法，盡可能減少試驗誤差，提高檢測數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

測量不確定度是完整試驗數(shù)據(jù)的一部分，最終得到的擴展不確定度即是測量結(jié)果在一定置信水平上的置信區(qū)間[14-15]。本試驗以多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣含量測定為例，對測量結(jié)果進行了不確定度評定，可以為其他保健食品中功效成分含量測定的評定和相關(guān)質(zhì)量標準的研究提供參考。