何雪丹，吳淑瑤，朱丹倩，成圣平

（1.浙江金正檢測(cè)有限公司，浙江義烏 322000；2.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州 310000）

合成著色劑包含日落黃、胭脂紅、莧菜紅、赤蘚紅、檸檬黃、亮藍(lán)和誘惑紅等[1]。日落黃為橙色的顆粒或粉末、無(wú)臭、易溶于水、不溶于油脂，0.1%水溶液呈橙黃色。日落黃，由對(duì)氨基苯磺酸重氮化，與2-萘酚-6-磺酸偶合，經(jīng)精制而得有一定的毒性[2]。與天然色素相比，日落黃價(jià)格低廉、顏色鮮艷、不易褪色，因此雖然過(guò)量攝入會(huì)引起人體過(guò)敏、腹瀉，且攝入量超過(guò)肝臟負(fù)荷時(shí)，會(huì)在體內(nèi)蓄積，對(duì)腎臟、肝臟產(chǎn)生一定傷害，但日落黃在食品中的不規(guī)范使用的現(xiàn)象仍廣泛存在[3-4]。

鹵肉制品是我國(guó)傳統(tǒng)的一大類肉制品，歷史悠久，受眾廣泛[5]。鹵肉制品中不允許添加合成著色劑，目前對(duì)鹵肉制品中合成著色劑的檢測(cè)參照《食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35—2016）、《肉制品 胭脂紅著色劑測(cè)定》（GB/T 9695.6—2008）、《食品中誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè)》（SN/T 1743—2006）等標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，但以上標(biāo)準(zhǔn)中的聚酰胺粉吸附法、液-液分配法等方法存在實(shí)驗(yàn)過(guò)程煩瑣、重現(xiàn)性差、檢測(cè)成本高等現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，無(wú)法滿足實(shí)際檢測(cè)需要。因此，需要建立一種方便、快捷、重現(xiàn)性好、實(shí)用性高、包容性大的日落黃檢測(cè)方法，用于批量檢測(cè)市場(chǎng)在售的相關(guān)食品。此方法的建立，對(duì)加大日落黃的監(jiān)管力度，保證我國(guó)居民食品衛(wèi)生安全有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；3-18KS高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）；純水凈化儀（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司）；MS3basic振蕩器（IKA公司）。

日落黃（純度99.00%）購(gòu)于北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取適量日落黃標(biāo)準(zhǔn)品，以水為溶劑，配制成100 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，避光冷藏保存；按需要用水稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 色譜條件

Thermo Scientific C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫 25 ℃；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL；流動(dòng)相A為0.02 mol/L乙酸銨，B為甲醇；梯度洗脫程序：0 min，11%B；0～4 min，11%～60%B；4～7 min，60%～95%B；7～8 min，95%B；8～10 min，95% ～ 60%B；10～ 11 min，60% ～11%B；11 min，11%B。

1.2.3 提取方法

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）均勻樣品于50 mL具塞離心管中，加入25 mL超純水，渦旋振蕩1 min，混勻，用超純水定容至50 mL，放入80 ℃水浴30 min，每隔10 min搖勻1次，水浴結(jié)束后，在6 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min。取上清液過(guò)0.45 μm水相濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)選取 Thermo Scientific C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在紫外檢測(cè)器150～600 nm波長(zhǎng)下對(duì)日落黃進(jìn)行波段掃描，波長(zhǎng)為270 nm和480 nm處有吸收峰，實(shí)驗(yàn)表明，270 nm下目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰并不能明顯分離、干擾較大，480 nm下則能達(dá)到較好的分離效果。

2.1.2 流動(dòng)相體系優(yōu)化

選定0.02 mol/L的乙酸銨-甲醇作為流動(dòng)相，同一濃度進(jìn)樣，改變流動(dòng)相比例，比較分離效果及保留時(shí)間。本試驗(yàn)選取0.02 mol/L的乙酸銨-甲醇（50∶50）（V∶V）、（60∶40）（V∶V）、（70∶30）（V∶V）和（80∶20）（V∶V）等度洗脫以及梯度洗脫對(duì)比。由圖1和圖2可知，0.02 mol/L乙酸銨-甲醇（70∶30）（V∶V）的等度洗脫方式與1.2.2中的梯度洗脫方式相比，在保證分離效果的情況下都能保證較短的分離時(shí)間，節(jié)省時(shí)間及流動(dòng)相成本。考慮到在實(shí)際檢測(cè)中與其他合成著色劑共同檢測(cè)，本試驗(yàn)選擇了梯度分離方式。因此本法選用480 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，選取0.02 mol/L乙酸銨-甲醇梯度洗脫為流動(dòng)相體系。

圖1 梯度洗脫日落黃標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

圖2 等度洗脫日落黃標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

2.2 提取條件選擇

2.2.1 提取劑及提取方式的選擇

本試驗(yàn)選取已知日落黃含量的鹵肉陽(yáng)性樣品，在相同提取時(shí)間下，比較不同溫度熱水浴、超聲水浴、乙醇超聲提取的提取效率。試驗(yàn)結(jié)果如表1，結(jié)果表明日落黃不溶于乙醇，超聲提取的作用不大，熱水浴提取效果最佳。其中當(dāng)熱水浴溫度≥80 ℃后，提取效果趨于穩(wěn)定，考慮到節(jié)約能效及實(shí)驗(yàn)安全，試驗(yàn)表明80 ℃水浴提取為回收率最高的提取方式。

表1 不同提取方式的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 提取時(shí)間的優(yōu)化

由表2可知，選定80 ℃水浴為提取方式，將已知日落黃含量的鹵肉陽(yáng)性樣品分組，分別水浴提 取 5 min、15 min、30 min、45 min、60 min和80 min，比較回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間≥30 min后，回收率趨于穩(wěn)定，考慮節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)，提高效率，本試驗(yàn)選取30 min為最佳提取時(shí)長(zhǎng)。

表2 不同提取時(shí)間的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 方法線性關(guān)系、精密度和檢出限

由表3、表4可知，日落黃在0.05～5.00 μg/mL線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，鹵肉樣品基質(zhì)中在3個(gè)濃度水平加標(biāo)試驗(yàn)回收率在81.0%～93.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.21%～2.51%，方法檢測(cè)限（LOD，S/N≥3）為0.5 mg/kg。本方法方便、快捷、重現(xiàn)性好、實(shí)用性高及包容性大。

表3 日落黃的線性方程、儀器檢出限及方法檢出限

表4 鹵肉中低中高濃度加標(biāo)回收率和精密度

圖3 日落黃檢出限（0.05 μg/mL）HPLC圖譜

3 方法驗(yàn)證

應(yīng)用本方法對(duì)隨機(jī)抽取的鹵肉樣品進(jìn)行測(cè)定，共計(jì)40個(gè)樣品。其中1個(gè)樣品檢出日落黃，檢出濃度為0.017 g/kg，其余39批未檢出。對(duì)比本方法與日常用于檢測(cè)食品中合成著色劑的方法，實(shí)驗(yàn)效率顯著提升，實(shí)驗(yàn)成本有所下降，因此本實(shí)驗(yàn)適用于日常大批量的樣品檢驗(yàn)。

4 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測(cè)定鹵肉制品中日落黃含量的方法。與日常使用的標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本方法在保證準(zhǔn)確性好、靈敏度高的同時(shí)，盡可能省去了復(fù)雜的前處理，提高了實(shí)驗(yàn)效率。本方法方便、快捷、重現(xiàn)性好、實(shí)用性高、包容性大，檢測(cè)結(jié)果可靠，本方法的建立為食品中測(cè)定鹵肉制品中日落黃含量的研究提供了數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。