李靈巧 林圓圓 朱振華

[摘要] 目的 研究微小RNA-300（miR-300）小干擾RNA（siRNA）沉默對博來霉素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的修復(fù)作用及作用機制。 方法 選取雄性SD大鼠32只，隨機選取8只為正常組，其余24只建立博來霉素誘導(dǎo)的急性肺損傷模型，隨機分為模型組、對照組、沉默組各8只。熒光定量PCR檢測miR-300表達，統(tǒng)計大鼠肺功能，雙抗體夾心法檢測炎癥因子水平，免疫印跡檢測核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶1（HO-1）通路蛋白表達。結(jié)果 與正常組比較，其他三組大鼠Ri、Re、IL-6、TNF-α、IL-1β、Nrf2、HO-1水平較高，Cdyn水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，沉默組、對照組Ri、Re、IL-6、TNF-α、IL-1β、Nrf2、HO-1水平較低，Cdyn水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，沉默組Ri（12.36±2.26）%、Re（13.58±3.59）%、IL-6（27.59±7.59）ng/L、TNF-α（54.95±5.59）ng/L、IL-1β（17.96±3.52）ng/L、Nrf2（0.36±0.10）、HO-1（0.38±0.09）水平較低，Cdyn（24.59±6.51）%水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 miR-300 siRNA沉默能提高博來霉素誘導(dǎo)急性肺損傷的大鼠模型的修復(fù)作用，改善大鼠肺功能，抑制炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與Nrf2、HO-1通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] miR-300;博來霉素;急性肺損傷;修復(fù);炎癥反應(yīng)

[中圖分類號] R614.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）36-0029-04

Analysis of repair effect and mechanism of miR-300 siRNA silencing on bleomycin-induced acute lung injury in rats

LI Lingqiao? ?LIN Yuanyuan? ?ZHU Zhenhua

Department of Pediatrics， Taizhou Central Hospital （Taizhou University Hospital）， Taizhou? ?318000， China

[Abstract] Objective To study the repair effect and mechanism of microRNA-300 （miR-300）small interfering RNA （siRNA） silencing on bleomycin-induced acute lung injury in rats. Methods Thirty-two male SD rats were selected， 8 of which were randomly selected as the normal group. The remaining 24 were used to establish a bleomycin-induced acute lung injury model. They were randomly divided into the model group， the control group， and the silent group， with eight rats in each group. Fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of miR-300. The rat lung function was calculated. The double-antibody sandwich method was used to detect inflammatory factor levels. Western blotting was used to detect the protein expression of nuclear factor E2 related factor 2（Nrf2 ） and heme oxygenase 1 （HO-1） pathway. Results Compared with the normal group， the other three groups had higher levels of Ri， Re， IL-6， TNF-α， IL-1β， Nrf2， HO-1， and a lower level of Cdyn，the difference was statistically significant（P<0.05）. Compared with the model group， the silent group and the control group had lower levels of Ri， Re， IL-6， TNF-α， IL-1β， Nrf2， and HO-1， and a higher level of Cdyn，the difference was statistically significant（P<0.05）. Compared with the control group， the silent group had lower levels of Ri（12.36±2.26）%， Re（13.58±3.59）%， IL-6 （27.59±7.59）ng/L， TNF-α （54.95±5.59）ng/L， IL-1β （17.96±3.52）ng/L， Nrf2 （0.36±0.10）， HO-1 （0.38±0.09）， and a higher level of Cdyn（24.59±6.51）%， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion miR-300 siRNA silencing can improve the repair effect of bleomycin-induced acute lung injury in rat models， improve rat lung function， and inhibit inflammation. Its mechanism may be related to Nrf2 and HO-1 pathways.

[Key words] miR-300; Bleomycin; Acute lung injury; Repair; Inflammatory response

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）指各種內(nèi)外應(yīng)激源所導(dǎo)致的彌漫性肺泡實質(zhì)損傷和急性進行性呼吸脅迫癥，常表現(xiàn)頑固性低氧血綜合征，是全身炎癥綜合征體內(nèi)失控的持續(xù)性自我放大和破壞過程，釋放多種炎癥因子[1-2]。miRNA可通過影響靶基因的表達而調(diào)控炎癥通路和免疫反應(yīng)，在ALI發(fā)病過程中起重要作用[3]。miR-300調(diào)控的潛在靶基因在多種生物學(xué)進程如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等發(fā)揮重要作用[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)[5]，miR-300在ALI中高表達，有望成為治療ALI的潛在靶點。目前急性肺損傷的治療未取得重要進展且單一藥物治療效果差[6]。本研究旨在分析miR-300 siRNA沉默對博來霉素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的修復(fù)作用及作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取清潔、健康的雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量183～216 g，鼠齡為3～4個月，體重250～310 g，平均（266.00±28.50）g，大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）20120001。

1.2 方法

1.2.1 博來霉素誘導(dǎo)急性肺損傷模型[7]的建立? 將清潔及健康32只雄性大鼠在適宜環(huán)境下飼養(yǎng)1周，隨機選取8只大鼠為正常組，注射同等量生理鹽水，其余24只建立博來霉素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠模型，2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，固定大鼠后行頸前正中切開，暴露氣管，采用0.4%的博來霉素0.24 mL緩慢注射大鼠氣管內(nèi)，將頭部抬高45°在氣管內(nèi)注射博來霉素，注藥后縫合切口，將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。密切觀察大鼠的呼吸情況，防止窒息。

1.2.2 分組及干預(yù)? 24只模型大鼠隨機分為模型組、對照組、沉默組各8只。siRNA沉默轉(zhuǎn)染靜脈輸入miR-300實現(xiàn)，100 nM轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染miR-300，分為沉默組，對照組使用100 nM轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染干預(yù)，由中國廣州銳博公司提供。模型組、正常組均靜脈注射等體積的生理鹽水。各組均連續(xù)干預(yù)5 d。

1.2.3 miR-300表達檢測? 將大鼠固定隱靜脈處采1 mL血液，3000 r/min離心10 min，取上層血清，-20℃凍箱備用。用ABI7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體步驟按照說明書嚴(yán)格操作。用2-ΔΔCt法計算miR-300表達。

1.2.4 炎癥因子及通路蛋白指標(biāo)檢測? 雙抗體夾心法檢測炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平，免疫印跡法檢測Nrf2、HO-1表達，具體步驟嚴(yán)格按照說明書進行操作。

1.2.5 肺功能相關(guān)指標(biāo)監(jiān)測? 給所有大鼠腹腔注射水合氯醛3% 0.001 mL/g麻醉處理。等待5 min，行氣管插管，仰臥放入動物肺功能分析系統(tǒng)體描箱中，然后連接氣管插管和體描箱的氣路，數(shù)據(jù)曲線穩(wěn)定后開始采集各組大鼠Ri、Re、Cdyn數(shù)據(jù)值。

1.2.6 病理學(xué)觀察? 干預(yù)5 d后，用頸椎脫臼法處死大鼠，迅速采集其左肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定。將其部分左肺組織常規(guī)制作石蠟切片并進行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下比較各組肺組織病理學(xué)形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能指標(biāo)水平比較

與正常組比較，其他三組Ri、Re水平較高，Cdyn水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，沉默組、對照組Ri、Re水平較低，Cdyn水平較高;與對照組比較，沉默組Ri、Re水平較低，Cdyn水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠炎癥因子水平比較

與正常組比較，其他三組IL-6、TNF-α、IL-1β水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，沉默組、對照組IL-6、TNF-α、IL-1β水平較低;與對照組比較，沉默組IL-6、TNF-α、IL-1β水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組肺組織病理學(xué)觀察

正常組支氣管壁及肺泡結(jié)構(gòu)正常，氣管黏膜上皮完整、管腔內(nèi)無黏液滲出;沉默組支氣管管壁結(jié)構(gòu)良好，管周組織存在少許滲出物，浸潤非常輕;對照組支氣管管壁少量結(jié)構(gòu)紊亂，管周組織存在滲出物，浸潤較重;模型組支氣管結(jié)構(gòu)紊亂，管腔內(nèi)炎性滲出物，上皮細(xì)胞充塞，充血水腫，管壁平滑肌增厚。見封三圖15。

2.4 miR-300對急性肺損傷大鼠通路蛋白的影響

與正常組比較，其他三組Nrf2、HO-1水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，沉默組、對照組Nrf2、HO-1水平較低;與沉默組比較，對照組Nrf2、HO-1水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

急性肺損傷是嚴(yán)重危害人體健康的疾病。早期預(yù)測患者病情嚴(yán)重程度及發(fā)病機制，進而針對其進行治療，對提高預(yù)后及降低病死率具有重要意義[8-9]。急性肺損傷主要是蛋白酶和失衡、促炎細(xì)胞過度釋放，發(fā)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)生中涉及到多種細(xì)胞和炎癥因子，嚴(yán)重?fù)p害患者身心健康[10]。

siRNA指雙鏈RNA引起與其同源的mRNA特異性降解，抑制基因表達，具有特異性強、效率高等優(yōu)越性，在基因治療和藥物開發(fā)等許多領(lǐng)域，有廣闊的前景[11-12]。曾宗鼎等[13]研究顯示，在博來霉素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠模型中miR-300參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，在維持生物體自身穩(wěn)態(tài)、調(diào)控炎性介質(zhì)方面也發(fā)揮重要作用。

急性肺損傷發(fā)生時，引起機體氧自由基的損傷，增強肺功能應(yīng)激水平，通過直接、間接作用導(dǎo)致肺組織損傷[14]。本研究顯示，miR-300沉默可通過降低大鼠Ri、Re水平，提高Cdyn水平，改善大鼠的肺功能。TNF-α、IL-1β是反映機體炎癥反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[15-16]。TNF-α可以誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生和釋放及中性粒細(xì)胞的趨化和激活，直接損傷組織細(xì)胞[17]。IL-6、TNF-α、IL-1β炎癥因子在肺局部的活化，增強肺組織細(xì)胞通透性，使大量高蛋白液體進入肺部，改變肺部生理穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)急性肺損傷[18-19]。本研究結(jié)果顯示，博來霉素誘導(dǎo)大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高，沉默miR-300的大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯降低，說明miR-300沉默能抑制炎癥反應(yīng)。

有研究顯示[20]，Nrf2-Keapl-ARE信號通路是細(xì)胞內(nèi)防御機制，上調(diào)信號通路可誘導(dǎo)下游抗氧化酶及解毒酶，提高抗氧化物表達，清除自由基，維持細(xì)胞平衡狀態(tài)，從而發(fā)揮保護作用，HO-1除了降血紅素外，還可以通過調(diào)控機制產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。本研究顯示，miR-300可通過調(diào)控Nrf2、HO-1通路蛋白水平，促進急性肺損傷大鼠的恢復(fù)。

綜上所述，miR-300 siRNA沉默對博來霉素誘導(dǎo)大鼠能夠改善肺功能相關(guān)指標(biāo)，抑制炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與Nrf2、HO-1通路蛋白有關(guān)，為急性肺損傷治療提供理論依據(jù)。但本研究為小樣本研究，其結(jié)論可能存在一定的片面性和局限性，今后仍需更多的臨床研究來證實。

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（收稿日期：2021-07-12）