楊 敏, 李 帥, 曹慧翔, 黃 婷, 李 媛, 謝軍偉, 趙耕毛

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省海洋生物學(xué)重點實驗室, 江蘇 南京 210095)

在過去幾十年里，土壤鹽堿化導(dǎo)致全球主要糧食作物減產(chǎn)超過50%[1-3]。據(jù)預(yù)測，到2050年，地球上1/2的可耕地將受到土壤鹽堿化的影響[4]。江蘇灘涂面積76.7萬hm2，占全國總面積的1/7，灘涂的開發(fā)和利用對江蘇乃至中國都具有重大意義[5-7]。因此，合理開發(fā)利用與有效改良鹽堿地，增加作物種植面積是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重中之重，是解決糧食供需矛盾的根本途徑之一。

鹽堿地改良主要包括水利、物理、化學(xué)和生物等措施[8-9]。種植耐鹽植物，是一項行之有效的鹽土生態(tài)改良方法，而且還可以獲得一定的經(jīng)濟效益[10]。植物根系作為聯(lián)系地上和地下生態(tài)系統(tǒng)的主要媒介，能夠感應(yīng)外界脅迫，并通過產(chǎn)生不同的分泌物進行自身調(diào)節(jié)。根系分泌物為微生物提供重要的營養(yǎng)和能量物質(zhì)，其成分和數(shù)量影響根際微生物的種類和繁殖；根際微生物的代謝作用，直接促進根的營養(yǎng)吸收和生長，也影響著根際土壤中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。甜菜、玉米、大豆的根系分泌物中氨基酸、有機酸等成分使作物土壤微生物數(shù)量、微生物量碳氮、土壤酶活性均顯著增加，且不同植物分泌物含量不同，微生物活性也存在一定的差異[12]。在抗鹽堿牧草星星草的根系分泌物中含有有機酸，星星草通過根系分泌物中有機酸的作用，調(diào)節(jié)了外部土壤環(huán)境的pH值，以此來適應(yīng)環(huán)境的變化[13]。在小麥的生長發(fā)育過程中，根系分泌物的增加，為根際土壤中反硝化細菌的發(fā)育創(chuàng)造了良好的生態(tài)環(huán)境，使根際環(huán)境中反硝化細菌數(shù)明顯增加；同時根系分泌物還能刺激反硝化細菌的代謝活動[14]。研究顯示，根系分泌物在抑制病原菌的生長方面也具有重要的作用，如番茄根系分泌物中咖啡酸增強了生物炭對青枯菌的吸附，抑制了青枯菌的泳動能力，減少了青枯菌數(shù)量，降低了發(fā)病率[15]。菊芋作為廣受學(xué)界關(guān)注的耐鹽植物，近年來它的生態(tài)功能及其應(yīng)用價值突顯了出來，主要表現(xiàn)在生態(tài)適應(yīng)性強，耐貧瘠，耐寒，耐旱，耐鹽堿，抗風沙能力強，其作為能源植物應(yīng)用潛力巨大[16]。在萊州灣濱海鹽堿地進行“南芋1號”連作種植試驗，連作5 a后，土壤有機質(zhì)含量呈增加態(tài)勢，全鹽含量下降，還原糖與纖維素含量達到最大值，表明種植菊芋在鹽堿地改良方面具有重要的作用[17]。但是，隨著連作年限的增長，土壤性質(zhì)有所下降，鹽堿地改良效果不佳。目前關(guān)于菊芋改良鹽堿地的研究多集中在其生物量和生理特性等方面[18-19]，鮮有人對菊芋改良鹽堿地的生物機制進行研究。為此，本研究通過菊芋種植與原生植物堿蓬對比，試圖通過研究菊芋根系分泌物，闡明植物與土壤微生物的關(guān)系，揭示菊芋根系分泌物介導(dǎo)的鹽土改良的生態(tài)學(xué)機制，為鹽土改良與生境改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及及保存

試驗地點為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豐灘涂農(nóng)牧化試驗與成果轉(zhuǎn)化基地，位于江蘇省鹽城市大豐區(qū)大豐港王港新閘附近(120°45′E，33°19′N)。該地區(qū)四季分明，氣溫適中，雨量充沛，年平均氣溫為14.1 ℃，無霜期213 d，常年降水量1 042.2 mm，日照2 238.9 h。研究區(qū)土壤類型為濱海鹽土。供試土壤基本理化性質(zhì)詳見表1。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

2019年10月，以菊芋和堿蓬為采樣對象，二者生長時間相同，均在10月下旬收獲，初始菊芋種植樣地與堿蓬原生樣地一致。野外試驗樣地設(shè)置3個重復(fù)，每個處理樣地面積60 m2(10 m×6 m)，長方形樣地上S形5個點上隨機取樣。去除表層土，收集距離根1—2 mm的土壤和根表面及其黏附的土壤作為根際土，距離根1—5 cm的土壤作為非根際土[20-21]。將5個樣本的根際土和非根際土各自混勻后，采用四分法取1～2 kg土樣，去除雜質(zhì)。一部分土壤樣品置于-80 ℃冷凍保存，用于隨后的脫氧核糖核酸提取和分析。剩余土壤樣品放置陰涼處風干后，分別過1和0.25 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.2 根系分泌物的組成成分的測定

(1) 土壤中單糖及低聚果糖。按照Zheng等[22]的方法配置單糖和低聚果糖的標準儲備液，然后用60%乙腈逐級稀釋，配成標準品濃度為2，1，0.5，0.25，0.1，0.01 mg/L的混合標準溶液，于4 ℃冰箱貯存，備用。

稱取5 g樣品(精確至0.01 g)置于50 ml離心管中，分別加入水20 ml，渦旋混勻，超聲提取40 min后，得到浸提液。準確移取浸提液5 ml于10 ml容量瓶中，用60%乙腈定容，渦旋混勻后，5 000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液過0.2 μm的濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析[23]。

(2) 土壤中烷烴、烯烴、芳烴、酯、醇、酮、醛、有機酸等。利用乙酸乙酯(比例1∶10)對土樣進行浸提，所得提取液過濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，過0.22 μm濾膜后，GC-MS測定分析，色譜和質(zhì)譜分析條件參考Wang等[24]的方法。

1.3 土壤微生物的測定

采用稀釋平板法計數(shù)測定土壤中微生物的數(shù)量[25]。土壤微生物量碳氮的測定參考Brookes等[26]的方法。土壤微生物多樣性的分析，首先稱取0.3 g土進行基因組DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。利用引物338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806 R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行PCR擴增，采用20 μL擴增體系，PCR反應(yīng)退火溫度55 ℃。

PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量，構(gòu)建Miseq文庫。Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU及其聚類分析結(jié)果，可以對OTU進行多種多樣性指數(shù)以及群落結(jié)構(gòu)的進行統(tǒng)計分析。

1.4 土壤酶活性測定

使用北京索萊寶科技有限公司的土壤過氧化氫酶(Soil-catalase，S-CAT)、土壤脲酶(soil-urease，S-UE)、土壤蔗糖酶(soil-sucrase，S-SC)、土壤堿性磷酸酶(soil alkaline phosphatase，S-AKP/ALP)試劑盒測定土壤酶的活性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 22及Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis軟件進行處理、統(tǒng)計，以平均值(Mean)表示，采用Duncan新復(fù)極差法進行顯著性分析，最終描述性統(tǒng)計值使用平均值±標準差。并利用Microsoft Excel 2010，Origin 2020，Qiime 1.9.1軟件等軟件進行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋根系分泌物的組成

試驗確定果糖(FRU)、葡萄糖(GLU)、蔗糖(SUC)、蔗果三糖(DP3)、蔗果四糖(DP4)和蔗果五糖(DP5)的分子量分別為178.9，178.8，341.0，503.4，665.3和827.3 m/z，以該分子離子峰為母離子，對其子離子進行全掃描，獲得二級質(zhì)譜響應(yīng)較強的子離子(圖1)。

圖1 FRU，GLU，SUC，DP3，DP4，DP5標準品的二級掃描質(zhì)譜圖

對每種糖的二級質(zhì)譜參數(shù)如碎裂電壓和碰撞能量等進行優(yōu)化，使每種糖的定性和定量離子產(chǎn)生的離子對強度比例達到最大值時為最佳，得到FRU，GLU，SUC，DP3，DP4和DP5的質(zhì)譜參數(shù)(表2)。

表2 果糖、葡萄糖、蔗糖、聚合度3～5的菊糖的質(zhì)譜參數(shù)

不同糖類的碎裂電壓和碰撞能量不同，離子響應(yīng)強度存在差異，一般碎裂離子穩(wěn)定好，離子響應(yīng)強度也會比較高。通過與標品中定性離子進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FRU，GLU，SUC，DP3，DP4，DP5的碎片離子在菊芋根際土壤中均存在，菊芋非根際和堿蓬土壤中僅含有FRU，GLU和SUC的碎片離子(圖2)。因此，在菊芋根際土壤中存在果糖、葡萄糖、蔗糖以及低聚果糖，但是在菊芋非根際和堿蓬土壤中僅存在果糖、葡萄糖和蔗糖，并沒有低聚果糖。

圖2 菊芋根際、菊芋非根際、堿蓬根際、堿蓬非根際的二級掃描質(zhì)譜圖

土壤中DP3—5的含量低于0.01 mg/L，此時儀器不能自動積分，手動積分獲得的峰面積誤差較大，本試驗選取含量大于0.01 mg/L的FRU，GLU及SUC進行定量。以峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程(表3)。

表3 FRU，GLU和SUC峰面積和濃度的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

結(jié)果顯示，菊芋土壤中的FRU，GLU和SUC含量分別為2.343，4.235和2.67 mg/kg，均顯著高于堿蓬土壤中的含量，且菊芋根際中的糖含量顯著高于非根際(p<0.05)(表4)。其中，以FRU含量的變化最明顯，菊芋根際土壤中的FRU含量高達2.163 mg/kg，約為非根際中FRU含量的12倍；在堿蓬土壤中，根際和非根際的FRU含量也存在顯著性差異(p<0.05)非根際中FRU含量為根際的2.15倍。

表4 菊芋和堿蓬根際和非根際土壤中FRU，GLU和SUC的含量 mg/kg

菊芋根系分泌物除了含有各種糖類，還有一些小分子、易揮發(fā)的化合物，這些物質(zhì)在菊芋、堿蓬土壤中分布不均，菊芋根際土壤相較于堿蓬土壤，分泌物較多，有32種，包括醇(6種)、酚(1種)、醛(3種)、酮(2種)、酸(2種)、烴(11種)、酰胺(2種)、酯(5種)，菊芋非根際土壤中有25種，堿蓬根際有8種，非根際有17種(表5)。菊芋土壤中特有的分泌物有23種，分別為1-氯—十八烷、正十六烷酸、2-甲基-Z-4-十四碳烯、十二酮、(Z)-9-十八碳酰胺、苯丙酸十六烷基酯等；菊芋和堿蓬共有的有6種，包括1-庚四醇、1,54-二溴四環(huán)十二烷、五氟丙酸四三烷基酯等。除9,9-二甲氧基雙環(huán)[3.3.1]壬烷-2,4-二酮外，堿蓬根系分泌物在菊芋土壤中均存在，無特有的根系分泌物。

表5 菊芋和堿蓬土壤中根系分泌物的種類變化

2.2 根系分泌物對土壤微生物生物量的影響

菊芋土壤的微生物量碳、氮明顯高于堿蓬土壤，其值分別是堿蓬土壤的1.95和1.6倍，且菊芋根際的微生物量碳、氮約為非根際的1.69和1.50倍(表6)。菊芋根際土壤的微生物量碳氮比約為堿蓬土壤的1.11倍，但是并無顯著性差異。

表6 土壤微生物生物量碳氮和碳氮比

2.3 根系分泌物對土壤微生物數(shù)量的影響

菊芋土壤中微生物數(shù)量均顯著高于堿蓬(p<0.05)，約為堿蓬土壤的102～103倍，其中以土壤細菌數(shù)量占優(yōu)勢(表7)。在菊芋根際土壤中細菌、真菌、放線菌數(shù)量顯著高于非根際(p<0.05)，其數(shù)量約為非根際的1.13和2.24倍。

表7 菊芋和堿蓬根際土壤中的微生物數(shù)量

2.4 根系分泌物對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

菊芋和堿蓬根際土壤的微生物組成相似，相對豐度前10的優(yōu)勢種群分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、Patescibacteria等，但是每種菌群的分布存在差異，在菊芋土壤中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)豐富度明顯高于堿蓬，所占比重達90%(圖3)。在這4個優(yōu)勢種群中，菊芋土壤中的放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度顯著高于堿蓬(p<0.05)，變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)無顯著性差異(表8)。在菊芋土壤中存在一些特有的物種，包括硝棘菌門(Nitrospinae)、鹽厭氧菌門(Halanaerobiaeota)、柔膜菌門(Tenericutes)、達達菌門(Dadabacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)(圖4)。

圖4 門水平下的物種Heatmap圖

表8 菊芋和堿蓬土壤中優(yōu)勢功能菌群的差異顯著性分析

圖3 菊芋和堿蓬根際土壤的微生物門水平下的相對物種豐富度

2.5 根系分泌物對土壤酶活性的影響

菊芋土壤的蔗糖酶、脲酶及堿性磷酸酶活性均顯著高于堿蓬土壤(p<0.05)，其中菊芋根際土壤約為堿蓬土壤的1.97，1.86和2.44倍，非根際較堿蓬土壤增加了0.69，0.92和3.80倍，但菊芋土壤過氧化氫酶活性降低，根際和非根際土壤分別降低1.03和1.02倍(圖5)。菊芋根際土壤的脲酶和蔗糖酶活性較非根際顯著增加，分別為非根際土壤的1.06和1.18倍?？梢娺B續(xù)種植6 a菊芋部分土壤酶活性顯著增加。

3 討 論

土壤中微生物數(shù)量巨大、種類繁多，微生物多樣性影響著土壤的結(jié)構(gòu)、肥力及植物的生長發(fā)育等，而植物主要通過根際分泌物影響根際的微生物群落結(jié)構(gòu)，進而提高養(yǎng)分利用率，改善土壤性質(zhì)[27]。本研究明確了菊芋根系分泌物的組成成分，在菊芋根際土壤中含有果糖，葡萄糖，蔗糖，蔗果三糖，蔗果四糖及蔗果五糖，菊芋非根際和堿蓬土壤中只含有果糖，葡萄糖和蔗糖，沒有低聚果糖。菊芋根際土壤中，以果糖含量變化最明顯，約為堿蓬土壤的12倍，這是因為低聚果糖是由果糖分子聚合而成，經(jīng)根系分泌到土壤中，不會長期存在，而是在各種酶(內(nèi)切和外切)的作用下，會被進一步分解生成單糖，供植物微生物利用[28-29]。在菊芋根系分泌物中還發(fā)現(xiàn)了正十六烷酸，十八烷酸等各種有機酸類物質(zhì)，與楊慧等的試驗結(jié)果一致[30]。除此之外，低聚果糖作為鈣、鎂、鐵等礦物質(zhì)和微量元素的活化因子，在微生物菌群(乳酸菌等)的作用下發(fā)酵也會生成有機酸[31]。這些存在于土壤中的有機酸能夠與Ca，F(xiàn)e，A1等金屬元素形成內(nèi)絡(luò)鹽，導(dǎo)致周圍土壤內(nèi)的難溶性磷等營養(yǎng)物質(zhì)釋放，活化與穩(wěn)固植物根際潛在的營養(yǎng)成分[32-33]。

注：圖中不同字母表示處理間差異顯著p<0.05)。

菊芋根系分泌物種類多、含量高，分泌物中的糖類(果糖、葡萄糖、低聚果糖等)、氨基酸等，為土壤微生物提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。分泌物經(jīng)根系進入土壤中，被土壤中微生物分解利用，為根際微生物的生長和繁殖提供充足的碳源、氮源和其他一些營養(yǎng)元素，例如芽孢桿菌，一類好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性細菌，能分泌多種胞外產(chǎn)物，包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，還包括一些對碳水化合物有較強的消化能力的酶，幫助分解土壤中低聚糖類，供植物和土壤微生物利用[34-35]。

根際分泌物的種類和數(shù)量影響土壤微生物的數(shù)量、種類以及在土壤中的分布[36]。在根系分泌物的作用下，菊芋土壤中微生物數(shù)量及微生物生物量顯著高于堿蓬，功能菌如放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度顯著高于堿蓬。已知放線菌門大部分為腐生菌，促使土壤中的動物和植物遺骸腐爛，在自然界的氮素循環(huán)中也起著一定的作用[37]；酸桿菌門，為嗜酸菌，是土壤中最豐富的細菌菌群之一，豐度與土壤碳含量密切相關(guān)[38]。根系分泌物中十六烷、十三醇、苯酚等類物質(zhì)，均被看作具有一定程度的化感作用，十六烷分子量較小，化學(xué)結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜，可能是菊芋根系中十六酸的還原產(chǎn)物，具有很強的化感作用，能夠抑制病原菌的生長；苯丙酸十六烷基酯，屬于酚酸類物質(zhì)，它能夠抑制微生物產(chǎn)生氣體以及揮發(fā)性脂肪酸，有效的減少微生物對其生長介質(zhì)的消耗[39-40]。

土壤微生物數(shù)量的增加及生物活性的提高等，讓更多的胞外酶釋放到土壤中，使土壤酶活性增加。土壤酶是土壤中具有生物活性的蛋白質(zhì)，它與微生物一起推動著土壤的生物化學(xué)過程，同時在物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起重要的作用，土壤酶活性高低是土壤肥力的重要指標之一。本研究中菊芋土壤的蔗糖酶、脲酶及堿性磷酸酶活性均顯著高于堿蓬，與楊生偉的研究結(jié)果一致[41]，土壤酶活性的增加促進了土壤有機化合物的分解和礦化作用，使土壤中有效養(yǎng)分的含量提高，促進了植物對養(yǎng)分的吸收利用。過氧化氫酶活性低于堿蓬，這是因為菊芋土壤的鹽分含量低于堿蓬，抑制了一些活性氧物質(zhì)(過氧化物和丙二醛)的產(chǎn)生，使土壤的過氧化氫酶活性降低[42]。

土壤底層和地下水中易溶性鹽類隨著土壤毛管水位的上升，在土壤表層逐漸積聚起來，造成鹽分堆積，使土壤出現(xiàn)鹽漬化現(xiàn)象[43]。種植菊芋使土壤微生物大量繁殖，提高了土壤有機質(zhì)、速效磷、堿解氮等的含量，降低了土壤pH值，改善了土壤結(jié)構(gòu)，從而使毛細管水運動的速度降低和減少了水分的無效蒸發(fā)，加速淋鹽、抑制返鹽，降低了土壤表層鹽分含量。此外，微生物分解有機物質(zhì)產(chǎn)生的有機酸也能使土壤吸附的鈣活化，加強了對土壤吸附性鈉的置換作用，導(dǎo)致脫鹽。綜上所述，菊芋通過根系分泌物(低聚果糖，有機酸，酚酸等)的作用，使土壤中微生物數(shù)量、生物量顯著增加，且土壤有益菌數(shù)量增多，改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，增加了土壤酶活性，提升了土壤生物活力，降低了土壤含鹽量，達到了改良鹽土的目的。

4 結(jié) 論

(1) 菊芋根系分泌物較堿蓬土壤更為復(fù)雜，種類多、含量高，且含有特有的分泌物如低聚果糖(蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖)、十八烷酸、十六烷等，為土壤微生物提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。

(2) 連年種植菊芋后，在根系分泌物的介導(dǎo)下土壤微生物大量繁殖，微生物總數(shù)量顯著增加，生物活性明顯提高，土壤有益菌群(Actinomarinales，Acidobacteria)相對豐度顯著增加(p<0.05)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化。

(3) 菊芋根系分泌物使土壤微生物活躍，促進了脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶的活性顯著增加(p<0.05)，酶活性的提高加速了土壤中有機化合物的分解和礦化作用，提高了土壤有效養(yǎng)分含量，改善了鹽漬土壤性質(zhì)。