楊德奕， 毛俊文， 趙德剛， 趙懿琛，

(1.貴州大學(xué)茶學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025;3.貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025)

花椒(ZanthoxylumpiperitumDC.)別名山椒，屬蕓香科花椒屬植物，常見為灌木或落葉小喬木[1]?；ń肪哂卸喾N藥理活性，并有顯著的抗真菌作用和抗細(xì)菌作用[2]。植物的幾丁質(zhì)酶是一種病程相關(guān)蛋白，在植物生長和發(fā)育過程中發(fā)揮作用，如在授粉、衰老、萌發(fā)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程[3-4]?？梢詫⒄婢募?xì)胞壁的成分幾丁質(zhì)為底物水解成寡聚糖，在植物對抗真菌病害中起重要作用，因而廣泛應(yīng)用于植物抗病基因工程[5]。楊晉明等[6]使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把水稻幾丁質(zhì)酶基因?qū)胩鸸掀贩N“雪脆蜜2號”，進(jìn)行了田間抗病的生物學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株提高了“雪脆蜜2號”對白粉病的抗性；羅晶晶等[7]接種白粉菌后在幾個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)對黃瓜抗病品種JIN 5-508的表型進(jìn)行觀察，并且取樣以測定幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量升高或降低，結(jié)果表明，接種白粉菌后JIN 5-508黃瓜的幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量有了明顯上升，尤其在接種白粉菌后的24 h時(shí)，抗病JIN 5-508黃瓜出現(xiàn)明顯的乳突反應(yīng)，以此來阻止白粉菌的入侵，說明在JIN 5-508黃瓜防御白粉菌侵染過程中幾丁質(zhì)酶基因起到了正向調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)組前期已證實(shí)幾丁質(zhì)酶存在于花椒的各部位(如莖、果實(shí)、葉等)以及對各部位表達(dá)量的高低進(jìn)行了研究[8]，但對花椒幾丁質(zhì)酶的原核表達(dá)以及純化并沒有進(jìn)行深入研究。

原核表達(dá)是指選取希望進(jìn)一步在體外表達(dá)大量蛋白質(zhì)的植物、動(dòng)物、微生物等目的基因與合適載體連接后導(dǎo)入大腸桿菌的方法。原核表達(dá)方法具有實(shí)驗(yàn)周期短，易于培養(yǎng)、生長以及使得實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前原核表達(dá)已被大量使用于蛋白定位、蛋白體外大量表達(dá)、蛋白純化及功能分析等方面[10]。陳麗娜[11]將擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的AtGT-3b基因克隆于原核表達(dá)載體pColdTF中，選取大腸桿菌BL 21進(jìn)行融合表達(dá),后通過純化得到大量的AtGT-3 b融合蛋白,基于此進(jìn)一步研究其AtGT-3b基因與GT-1順式作用元件在體外的相互作用。肖圣燕等[12]將桑樹幾丁質(zhì)酶基因Machi1與載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)菌株，經(jīng)純化后用得到的高純度Machi 1蛋白制備Anti-Machi 1多克隆抗體。

本研究使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)了pMCSG 19-ZaCHIT1基因重組載體，且優(yōu)化了其在體外的誘導(dǎo)表達(dá)體系，得到了在體外大量表達(dá)的ZaCHIT 1融合蛋白和純化后的重組ZaCHIT 1融合蛋白，為后續(xù)研究ZaCHIT1基因?qū)χ参镏锌拐婢淖饔脵C(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

原核表達(dá)載體菌株DH 5α-pMCSG 19-ZaCHIT1由武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室有限公司構(gòu)建。Premixed protein marker(Low)購自TaKaRa(大連)公司。蛋白純化試劑盒購自康為世紀(jì)公司。

1.2 DH 5α-pMCSG 19-ZaCHIT1重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL 21(DE 3)及驗(yàn)證

以武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室有限公司構(gòu)建的DH 5α-pMCSG 19-ZaCHIT1菌種為模板，進(jìn)行LB(100 mg·L-1Ampicillin，Amp)固體培養(yǎng)基平板劃線37 ℃下培養(yǎng)24～36 h，挑單菌落于LB(100 mg·L-1Ampicillin，Amp)液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床中培養(yǎng)12 h。引物為P 1-CGGGATCCATGAAGAAGGGCAATTTGGGA和P 2-CGGAATTCTCAAGACGAGGCATCTGCA進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。PCR 反應(yīng)體系為：菌液模板 2.0 μL，10×buffer 2.0 μL，rTaq酶0.1 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1)1.6 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足總體系至20.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，59.0 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)一共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 3 min。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取驗(yàn)證為陽性的菌株質(zhì)粒送武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室有限公司測序。

同時(shí)陽性質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)化表達(dá)于菌株BL 21(DE 3)感受態(tài)后，涂在LB(100 mg·L-1Ampicillin，Amp)固體培養(yǎng)基上，次日挑選單菌落，37 ℃搖床180 r·min-1培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR反應(yīng)體系為：質(zhì)粒模板0.5 μL，上下游(F、R)引物各0.2 μL，rTaq酶5 μL，ddH2O補(bǔ)足總體系至10.0 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，59.0 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min)總計(jì)35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 3 min。將產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳法(1.2%)進(jìn)行檢測，證實(shí)成功導(dǎo)入pMCSG 19-ZaCHIT重組表達(dá)載體。

1.3 ZaCHIT基因的原核表達(dá)

在5 mL含有LB液體培養(yǎng)基(Ampicillin，Amp，100 mg·L-1)中接種pMCSG 19-ZaCHIT菌株，溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的搖床中培養(yǎng)，待菌液吸光度OD600值為0.7左右時(shí)，加入IPTG(終濃度為1 mmol·L-1)，在100 r·min-1轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)12 h，將菌液16 000 r·min-1、2.5 min離心后棄掉上清，用500 μL Tris HCl溶解緩沖液(Tris HCl pH=7.4，200 mmol·L-1NaCl，1 mmoL·L-1DTT)重懸菌體，在冰上超聲破碎菌體后，加入2倍上樣緩沖液后，進(jìn)行10 min沸水浴，15%SDS-PAGE凝膠電泳分析檢測，上樣量為20 μL。

1.4 不同誘導(dǎo)條件對ZaCHIT重組蛋白原核表達(dá)的影響

將pMCSG 19-ZaCHIT的單菌落挑入在100 mL的LB液體(Amp，100 mg·L-1)培養(yǎng)基中，溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌液吸光度OD600值為0.7左右時(shí)。進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)長，誘導(dǎo)溫度，IPTG終濃度3個(gè)方面的單因素實(shí)驗(yàn)以得到最優(yōu)最大累積量的ZaCHIT重組蛋白。誘導(dǎo)時(shí)長(9 h，10 h，11 h，12 h，13 h，14 h)、誘導(dǎo)溫度(16 ℃，25 ℃，37 ℃)、IPTG誘導(dǎo)濃度(0.5 mmol·L-1，0.8 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1，1.2 mmol·L-1，1.5 mmol·L-1)。誘導(dǎo)后13 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心2.5 min，用同等體積的Tris-HCl溶解緩沖液重懸菌體沉淀，在冰上超聲破碎菌體后，加入2倍上樣緩沖液，進(jìn)行10 min沸水浴，15% SDS-PAGE凝膠電泳分析檢測，上樣量為20 μL。

1.5 ZaCHIT重組蛋白表達(dá)形式的鑒定

培養(yǎng)100 mL pMCSG 19-ZaCHIT菌液，當(dāng)檢測OD600值為0.7左右時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG，在誘導(dǎo)溫度為37 ℃，100 r·min-1的條件下誘導(dǎo)時(shí)長達(dá)到14 h。13 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心2.5 min收集菌體。菌體沉淀用Tris HCl溶解緩沖液重懸后冰上超聲破碎，充分破碎后13 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心4 min，上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中。再用2 mL的Tris HCl溶解緩沖液重懸沉淀，對其進(jìn)行上樣量為20 μL的15% SDS-PAGE 凝膠電泳檢測。

1.6 Ni-NTA親和層析純化方法純化ZaCHIT重組蛋白

使用蛋白純化試劑盒方法，平衡Ni柱后上樣，用不同濃度的咪唑親和洗脫液(20 mmol·L-1Tris-HCl，0.3 mol·L-1NaCl，200、300、500 mmol·L-1Imidazole)進(jìn)行洗脫柱子并收集不同濃度咪唑純化后蛋白。對得到的不同濃度咪唑純化后蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE凝膠電泳分析檢測。

1.7 Western Blot方法鑒定ZaCHIT 1重組蛋白

采用Western blot法(以40 kDa大小的對照樣品進(jìn)行對照)，用15% SDS-PAGE分離ZaCHIT 1重組蛋白后，電轉(zhuǎn)膜1.5 h轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后取出，用PBST溶液清洗過的PVDF膜于1%酪蛋白封閉液中浸沒，于37 ℃孵育2 h。再用PBST溶液清洗。將膜取出后，加入一抗華美鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)和二抗羊抗小鼠IgG(1∶3 000稀釋)，先后孵育60 min后，再轉(zhuǎn)移至PBST溶液容器中清洗3次。最后使用ECL法檢測掃描成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZaCHIT1基因及原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL 21(DE 3)的驗(yàn)證

將武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室有限公司構(gòu)建的DH 5 α-pMCSG 19-ZaCHIT1活化后，經(jīng)過菌落PCR驗(yàn)證(圖1)為陽性克隆。PCR擴(kuò)增得到的目的條帶與預(yù)期相符合，大小約為969 bp。測序結(jié)果顯示，NCBI上登錄的序列與結(jié)果序列一致，說明獲得的目的條帶確為ZaCHIT1基因。

將pMCSG 19-ZaCHIT1轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL 21(DE 3)中擴(kuò)增。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR后得到結(jié)果，PCR擴(kuò)增得到的目的條帶與預(yù)期相符合(圖2)，得到預(yù)期969 bp大小的片段。

2.2 ZaCHIT1基因的原核表達(dá)

用上步檢測出的pMCSG 19-ZaCHIT1原核表達(dá)陽性菌株搖菌后進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，加入IPTG(終濃度為1 mmol·L-1)，在16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)長達(dá)到12 h。進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)(圖3)：在77.51 kDa左右出現(xiàn)特異性條帶，成功表達(dá)出預(yù)期77.51 kDa大小的融合蛋白條帶(MBP 42 kDa+ZaCHIT135.51 kDa)，但條帶特異性不強(qiáng)，需提高其目的蛋白表達(dá)量。

2.3 優(yōu)化ZaCHIT1基因原核表達(dá)體系

2.3.1誘導(dǎo)時(shí)長對ZaCHIT1基因原核表達(dá)的影響

在pMCSG 19-ZaCHIT1菌液中加入IPTG(終濃度為1 mmol·L-1)，誘導(dǎo)溫度為16 ℃，誘導(dǎo)表達(dá)不同的時(shí)長。菌體經(jīng)過離心重懸后，進(jìn)行15% SDS-PAGE凝膠電泳分析，通過圖4可看出，誘導(dǎo)9～14 h之內(nèi)，誘導(dǎo)時(shí)長對特異性融合蛋白表達(dá)量沒有顯著影響，最適的誘導(dǎo)時(shí)長為14 h，因?yàn)樵谡T導(dǎo)14 h后的產(chǎn)物中目的蛋白表達(dá)量相對較大。

2.3.2溫度對誘導(dǎo)表達(dá)的影響

在pMCSG 19-ZaCHIT1菌液中加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，分別在16 ℃，25 ℃，37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)14 h。菌體經(jīng)過離心重懸后，進(jìn)行15% SDS-PAGE 凝膠電泳分析，通過圖5可看出，在16～37 ℃區(qū)間內(nèi)，誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)表達(dá)條帶最亮，而16 ℃和25 ℃表達(dá)條帶相對較弱，表明較適宜的ZaCHIT 1重組蛋白誘導(dǎo)溫度為37 ℃。

2.3.3IPTG濃度對誘導(dǎo)表達(dá)的影響

在pMCSG 19-ZaCHIT1菌液中分別加入5個(gè)梯度不同終濃度(0.5 mmol·L-1，0.8 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1，1.2 mmol·L-1，1.5 mmol·L-1)的IPTG，在37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)14 h。菌體經(jīng)過離心重懸后，進(jìn)行15% SDS-PAGE凝膠電泳分析，通過圖6可看出，在終濃度為0.5～1.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)區(qū)間內(nèi)，ZaCHIT 1蛋白的表達(dá)量對于加入IPTG的濃度并沒有顯著性差異，最適的IPTG誘導(dǎo)濃度為1 mmol·L-1，因?yàn)樵贗PTG誘導(dǎo)濃度為1 mmol·L-1時(shí)，誘導(dǎo)后的產(chǎn)物中目的蛋白表達(dá)量相對較大。

2.4 ZaCHIT 1重組蛋白表達(dá)形式的鑒定

將pMCSG 19-ZaCHIT1菌液加入終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG后，在37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)14 h，菌體經(jīng)過離心重懸后，再次離心后收集上清液和沉淀，進(jìn)行15% SDS-PAGE凝膠電泳分析，由圖7看出，上清中的特異性融合蛋白條帶較之沉淀中的特異性融合蛋白條帶有明顯的差異，可得到ZaCHIT 1重組蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。

2.5 ZaCHIT 1重組蛋白在親和層析純化中純化

利用蛋白純化試劑盒中Ni-NTA系統(tǒng)對pMCSG 19-ZaCHIT1誘導(dǎo)后蛋白上清液進(jìn)行純化，收集經(jīng)過不同濃度咪唑洗脫液(200、300、500 mmol·L-1)洗脫的蛋白組分進(jìn)行電泳分析，結(jié)果見圖8；可以看出，在經(jīng)過300 mmol·L-1咪唑洗脫液后的ZaCHIT 1重組蛋白濃度最大，ZaCHIT 1重組蛋白特異性條帶在77.51 kDa處。

2.6 ZaCHIT 1重組蛋白Western Blot的鑒定

利用His標(biāo)簽抗體對ZaCHIT 1重組蛋白進(jìn)行鑒定，通過ECL法，從圖9看出，在77.51 kDa處顯現(xiàn)出特異性目的條帶，但在35.51 kDa處也出現(xiàn)了條帶，推測應(yīng)為MBP標(biāo)簽斷裂后，只帶有了His標(biāo)簽的ZaCHIT 1重組蛋白。證明在BL 21(DE 3)菌株中已經(jīng)正確表達(dá)出ZaCHIT 1重組蛋白。

3 討 論

目前對于花椒抗菌基因功能研究和體外獲得、分析的研究還較少[13]，基本只集中在化學(xué)物質(zhì)分離和花椒中成分分析純化階段[14-15]。而本實(shí)驗(yàn)組前期已證實(shí)幾丁質(zhì)酶存在于花椒的各部位，但未對花椒中幾丁質(zhì)酶的作用進(jìn)行詳細(xì)研究。本研究通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pMCSG 19-ZaCHIT1，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL 21(DE 3)中進(jìn)行ZaCHIT 1重組蛋白分泌表達(dá)。

目前，在原核表達(dá)使用融合表達(dá)方法也愈來愈廣泛，因其可使在胞質(zhì)中更易得到正確折疊的外源蛋白，同時(shí)也更方便蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化[16]。其中使用較多的融合蛋白就有麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein,MBP)，且有研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中的MBP可直接與外源蛋白相結(jié)合，起到分子伴侶的作用，可有利于外源蛋白的折疊[17]。本研究為了更方便使ZaCHIT 1重組蛋白表達(dá)，從而構(gòu)建了含MBP標(biāo)簽和ZaCHIT1基因共計(jì)大小為77.51 kD的融合蛋白條帶。為了獲得更多的可溶性重組蛋白，分別從IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)長和誘導(dǎo)溫度這3個(gè)方面優(yōu)化了融合蛋白的表達(dá)條件。最終在37 ℃，1.0 mmol·L-1的IPTG濃度優(yōu)化條件下誘導(dǎo)表達(dá)14 h后成功表達(dá)了ZaCHIT 1重組蛋白，同時(shí)本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功使可溶性蛋白在濃度為300 mmol·L-1咪唑洗脫液下表達(dá)，經(jīng)過western blot分析也成功驗(yàn)證了在BL 21(DE 3)菌株中可正確表達(dá)出ZaCHIT 1重組蛋白。為后續(xù)研究ZaCHIT1基因?qū)χ参镏锌拐婢淖饔脵C(jī)制奠定基礎(chǔ)。