魏 鵬， 任彥青， 詹 虹， 張存智， 王 肖

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科技學(xué)院， 銀川 750021；2.寧夏農(nóng)墾賀蘭山種業(yè)有限公司馬鈴薯脫毒中心， 銀川 750021)

培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的比例決定外植體器官分化的方向[1]，如生根還是脫分化形成愈傷，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素的配比影響器官分化的生長(zhǎng)質(zhì)量[2-4]，如根的粗細(xì)、葉片大小等。但基本培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素種類(lèi)較多，且往往存在交互作用，優(yōu)化調(diào)整難度較大。許多組培配方的優(yōu)化僅停留在激素水平，這也是許多經(jīng)濟(jì)木本植物組培繁殖成本太高、難以工廠(chǎng)化生產(chǎn)的主要原因。

鈣果原名歐李(CerasushumilisBunge.)是薔薇科櫻桃屬的一種矮小灌木，是我國(guó)特有果樹(shù)，由于鈣果果實(shí)含鈣量極高，是兒童與老人的高級(jí)保健水果[5]，目前在寧夏境內(nèi)已經(jīng)推廣種植[6]，未來(lái)很可能成為繼枸杞、葡萄、樹(shù)莓之后的又一區(qū)域主推經(jīng)濟(jì)果樹(shù)[7]。通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖鈣果種苗相比扦插種苗基數(shù)使用較少，苗木發(fā)展初期有明顯優(yōu)勢(shì)[8]。關(guān)于鈣果的組培繁殖配方缺乏深度優(yōu)化，大多繞開(kāi)配方中影響器官分化質(zhì)量的營(yíng)養(yǎng)元素配比技術(shù)壁壘，因此苗子質(zhì)量不高[9]，多數(shù)苗子根較細(xì)[10]，有效增殖系數(shù)偏低。

本研究以鈣果4號(hào)(Cerasushumiliscv. Four)組培苗為例，研究其在生根基礎(chǔ)上的分枝增殖技術(shù)，先通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)確定出鈣果4號(hào)組培苗基礎(chǔ)生根配方中的生長(zhǎng)素種類(lèi)與濃度，然后借助均勻設(shè)計(jì)可大大減少試驗(yàn)次數(shù)的優(yōu)勢(shì)[11]，挑選科學(xué)匹配的均勻設(shè)計(jì)表，在該配方基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基中的5種營(yíng)養(yǎng)元素N、P、K、Ca、Mg對(duì)應(yīng)化合物含量進(jìn)行深度優(yōu)化，通過(guò)苗子生根質(zhì)量、腋芽萌發(fā)嫩梢質(zhì)量篩選一次成苗配方，為下一步工廠(chǎng)化生產(chǎn)與移栽奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鈣果4號(hào)外植體取自銀川市西夏區(qū)寧夏農(nóng)墾設(shè)施園區(qū)大棚內(nèi)(38°43′N(xiāo)，106°04′E)，苗子陸地生長(zhǎng)超過(guò)2年。試管苗繼代5次以上，生長(zhǎng)穩(wěn)定。

1.2 方 法

1.2.1基礎(chǔ)生根配方中生長(zhǎng)素種類(lèi)與濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

整個(gè)實(shí)驗(yàn)分3步進(jìn)行，第一，以孫新政等[10]的鈣果4號(hào)生根配方為對(duì)照(表1-ck)，采用MS配方，設(shè)置不同的生長(zhǎng)素處理水平，剪取生長(zhǎng)在同一配方中的鈣果4號(hào)試管苗莖尖苗、莖段苗分別接入表1中12個(gè)配方，35 d后統(tǒng)計(jì)、比較試管苗根的生長(zhǎng)狀況與莖葉生長(zhǎng)質(zhì)量。

表1 不同生長(zhǎng)素生根配方處理

1.2.2大量元素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以實(shí)驗(yàn)1的研究結(jié)果為基礎(chǔ)，利用均勻設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基中大量元素對(duì)應(yīng)的化合物KNO3、NH4NO3、MgSO4·7 H2O、Ca(NO3)2·4 H2O濃度進(jìn)行深度優(yōu)化。MS培養(yǎng)基中KH2PO4的溶液顯弱酸性，含量超過(guò)300 mg·L-1時(shí)培養(yǎng)基不凝固，處理配方中KH2PO4固定為1/2 MS濃度，為85 mg·L-1。均勻設(shè)計(jì)表選用官網(wǎng)http://www.math.hkbu.edu.hk/UniformDesign/4因素11水平試驗(yàn)U 11(114)，具體設(shè)置如表2所示。35 d后，統(tǒng)計(jì)苗子生根狀況，以生根率為因變量，各化合物濃度為自變量，建立多元二次回歸方程，利用Matlab軟件對(duì)該方程求最優(yōu)解。

表2 利用均勻設(shè)計(jì)對(duì)4種化合物進(jìn)行不同水平設(shè)置 單位：mg·L-1

1.2.3重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)激素一次優(yōu)化與營(yíng)養(yǎng)化合物二次優(yōu)化試驗(yàn)，得到鈣果4號(hào)組培苗一次成苗配方。分別將莖尖苗、莖段苗接入該配方培養(yǎng)基，觀(guān)察、統(tǒng)計(jì)苗子生長(zhǎng)狀況，對(duì)該配方效果進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

1.3 培養(yǎng)條件

莖尖與莖段分開(kāi)接種，長(zhǎng)度約1.3 cm，每種處理接種8瓶，每瓶5株苗。隨機(jī)擺放在培養(yǎng)架上，培養(yǎng)室溫度(26±2)℃，光照時(shí)間16 h·d-1，光照強(qiáng)度40 mol·(m2·s)-1。所有實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基加入蔗糖20 g·L-1, 瓊脂粉4.2 g·L-1.

1.4 數(shù)據(jù)處理與圖表制作

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與方程擬合使用SPSS 26.0軟件，圖表制作使用Origin 2019軟件和Excel 2019軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)素種類(lèi)與濃度的優(yōu)化

由表3可知，不同配方，鈣果4號(hào)莖尖試管苗生長(zhǎng)差別較大，7、8、9、10、11等5個(gè)配方試管苗大部分枯死，尤其是8、9、10三個(gè)配方，試管苗生根率≤10%，離陸地移栽標(biāo)準(zhǔn)相差甚遠(yuǎn)。ck配方生根率為53%，莖尖枯死嚴(yán)重，莖葉生長(zhǎng)不明顯，愈傷組織較大較硬，未達(dá)到理想效果。綜合生根率、生根數(shù)、莖葉鮮重及枯死狀況，3號(hào)配方IAA 1.0 mg·L-1+MS適合鈣果4號(hào)莖尖苗的生根培養(yǎng)，其中生根率與生根數(shù)2項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)突出。

表3 鈣果4號(hào)莖尖苗接入不同配方生長(zhǎng)狀況對(duì)比

通過(guò)表4發(fā)現(xiàn)，鈣果4號(hào)莖段苗在繼代培養(yǎng)時(shí)多數(shù)腋芽都能萌發(fā)成梢。相比表3，鈣果4號(hào)莖切段試管苗生根率整體低于莖尖苗，配方1、7、8、9、 10、11生根率極低，均≤11%，莖段苗生根狀況與莖尖苗表現(xiàn)整體一致性。生根率配方最高的是4號(hào)，達(dá)到70%，1、8、9三個(gè)配方均未生根，腋芽的萌發(fā)情況較差。相比其他配方， 3號(hào)在莖段試管苗中表現(xiàn)優(yōu)異，生根率為65%，生根條數(shù)較多，且較長(zhǎng)，另外腋芽萌發(fā)良好，成梢均一，葉片展平成綠，為后續(xù)繼代增殖提供了材料。綜合表4，生根質(zhì)量好的試管苗其主株高、腋芽萌發(fā)個(gè)數(shù)及腋梢長(zhǎng)度均表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，試管苗生長(zhǎng)與莖葉生長(zhǎng)表現(xiàn)密切相關(guān)。

2.2 營(yíng)養(yǎng)元素的優(yōu)化

將鈣果4號(hào)莖切段試管苗接入均勻設(shè)計(jì)的11個(gè)配方，如表5所示，配方之間苗子生長(zhǎng)狀況差別較大，生根率在70%～76%之間的共有5個(gè)配方，其中h配方最高，為75%，結(jié)合每株根長(zhǎng)、根數(shù)及腋芽萌發(fā)個(gè)數(shù)3項(xiàng)指標(biāo)，苗子生根質(zhì)量最優(yōu)的是配方e。生根率在60%～67%之間共有2個(gè)配方，剩余配方生根率均低于54%，其中b配方最低，為24%。3號(hào)配方與表4表現(xiàn)基本一致，與均勻設(shè)計(jì)其他配方相比，苗子生長(zhǎng)表現(xiàn)居中。

表4 鈣果4號(hào)莖段苗接入不同配方生長(zhǎng)狀況對(duì)比

表5 鈣果4號(hào)莖段苗接入均勻設(shè)計(jì)配方生長(zhǎng)狀況

通過(guò)11個(gè)配方的回歸分析，以鈣果4號(hào)莖切段試管苗生根率為依變量，各營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)應(yīng)化合物濃度為自變量，建立回歸方程：Y(生根率)=2.224[Ca(NO3)2·4 H2O]2+1.881[NH4NO3][Ca(NO3)2·4 H2O]-2.286[NH4NO3] [KNO3]-1.1[Ca(NO3)2·4 H2O] [MgSO4·7 H2O]+1.077[KNO3]+0.861[MgSO4·7 H2O]-2.98[Ca(NO3)2·4 H2O]+0.693，如圖5所示，R2=0.982，F(xiàn)=23.235，p值小于0.05，多元二次回歸方程擬合非常好。

利用軟件Matlab 22.0對(duì)上述回歸方程求最優(yōu)解，當(dāng)生根率Y等于最大值100%時(shí)，4種化合物的最優(yōu)解是：[Ca(NO3)2·4 H2O]340.4 mg·L-1+[NH4NO3]500.2 mg·L-1+[KNO3]9.3 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]567.9 mg·L-1。

圖1 11個(gè)配方苗子生根率實(shí)測(cè)值與方程計(jì)算值對(duì)比

2.3 重復(fù)驗(yàn)證

將鈣果4號(hào)試管苗莖尖苗與莖段苗分別接入最終優(yōu)化的生根配方3-1：蔗糖20 g·L-1+瓊脂粉4.2 g·L-1+[Ca(NO3)2·4 H2O]340.4 mg·L-1+[NH4NO3]500.2 mg·L-1+[KNO3]9.3 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]567.9 mg·L-1+[KH2PO4]85 mg·L-1。

如圖2所示，結(jié)合表3，配方3號(hào)與3-1莖尖苗腋芽均未萌發(fā)，這可能與該植物特性有關(guān)。莖尖苗生根率、生根數(shù)、根長(zhǎng)2個(gè)配方差別不大，莖葉生長(zhǎng)表現(xiàn)良好，無(wú)莖葉枯死現(xiàn)象。關(guān)鍵是莖切段苗，結(jié)合表4、表5，與配方3、h、e相比，生根率提高至87%，生根數(shù)、根長(zhǎng)等明顯提升。莖切段苗腋芽萌發(fā)個(gè)數(shù)達(dá)3.9個(gè)，細(xì)梢長(zhǎng)度為2.68 cm，嫩梢著生葉片展平成綠，長(zhǎng)勢(shì)良好，具備下次繼代有效增殖材料的剪切標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 鈣果4號(hào)莖尖、莖段苗在配方3-1中的生長(zhǎng)表現(xiàn)對(duì)比

3 討 論

試管苗的生根質(zhì)量直接影響后續(xù)移栽成活率，試管苗增殖系數(shù)偏低大大影響企業(yè)生產(chǎn)成本，因此生根技術(shù)與增殖技術(shù)是種苗能否工廠(chǎng)化生產(chǎn)的瓶頸[12]。本研究依據(jù)苗子生根質(zhì)量與莖葉生長(zhǎng)相關(guān)性的原理，巧妙利用鈣果4號(hào)莖段試管苗生根狀態(tài)下腋芽萌發(fā)成梢的特征，先通過(guò)生長(zhǎng)素對(duì)比試驗(yàn)，篩選出鈣果4號(hào)基礎(chǔ)生根配方3號(hào)：蔗糖20 g·L-1+瓊脂粉4.2 g·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+MS，將莖尖苗接入該配方，生根率為83%，每株根長(zhǎng)為3.18 cm，每株生根數(shù)為7條，莖葉生長(zhǎng)良好。莖段苗生根率僅為65%，生根質(zhì)量一般，但發(fā)現(xiàn)有部分腋芽萌發(fā)成梢。

實(shí)際生產(chǎn)中，莖段苗數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于莖尖苗，僅用莖尖苗移栽不符合生產(chǎn)需要。第二步，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)利用回歸分析結(jié)合Matlab軟件對(duì)3號(hào)配方的中營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)應(yīng)4種化合物濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到莖段苗生根率提升至87%，腋芽萌發(fā)個(gè)數(shù)達(dá)到3.9個(gè)，細(xì)梢長(zhǎng)度為2.68 cm的優(yōu)良配方3-1：蔗糖20 g·L-1+瓊脂粉4.2 g·L-1+[Ca(NO3)2·4 H2O]340.4 mg·L-1+[NH4NO3]500.2 mg·L-1+[KNO3]9.3 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]567.9 mg·L-1+[KH2PO4]85 mg·L-1，經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，苗子生長(zhǎng)良好。該舉措通過(guò)生根配方技術(shù)和增殖技術(shù)的突破，達(dá)到一次成苗雙贏(yíng)效果。

利用愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽是組培快速繁殖種苗的常用方式[12]，但芽體附著的葉片多簇?fù)?、幼嫩[13]，莖桿也細(xì)嫩[14]，成梢長(zhǎng)度有限[15]。通過(guò)腋芽萌發(fā)成梢相比叢生芽方式，增殖系數(shù)略低，但葉片展平良好，成熟度高，莖桿相對(duì)較粗較硬，潛在的有效繁殖能力明顯較強(qiáng)，這也是鈣果4號(hào)叢生芽質(zhì)量不高[9-10]，本實(shí)驗(yàn)利用鈣果4號(hào)莖段苗繼代培養(yǎng)時(shí)腋芽萌發(fā)成梢的特征，通過(guò)腋芽增殖的主要原因。采用二次優(yōu)化的配方3-1，保證了移栽的生根率，腋芽萌發(fā)成梢明顯，腋芽萌發(fā)接近4個(gè)，平均長(zhǎng)度為2.68 cm，在生根的基礎(chǔ)上，達(dá)到增殖的效果，縮減了組培中間環(huán)節(jié)，為試管苗繼代增殖及移栽后的陸地扦插提供了潛在材料。

培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)元素影響器官分化的質(zhì)量，從技術(shù)角度講，相比配方中激素的優(yōu)化，營(yíng)養(yǎng)元素及對(duì)應(yīng)化合物濃度的優(yōu)化難度太大，以MS為例，大量元素加微量元素共計(jì)12種，如果再設(shè)置不同的水平，實(shí)驗(yàn)次數(shù)就大大增加，因此組培配方的優(yōu)化大多停留在激素水平。均勻設(shè)計(jì)在多因子多水平條件下可以大大減少試驗(yàn)次數(shù)[11]，優(yōu)勢(shì)明顯，這與組培配方中營(yíng)養(yǎng)元素種類(lèi)較多，優(yōu)化繁雜具有較高的應(yīng)用契合度[16]。本實(shí)驗(yàn)核心研究就是利用均勻設(shè)計(jì)結(jié)合Matlab軟件對(duì)配方3中的大量元素進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)良配方3-1，提高了鈣果4號(hào)莖切段試管苗的繁殖效率，驗(yàn)證了均勻設(shè)計(jì)在組織培養(yǎng)配方優(yōu)化領(lǐng)域的科學(xué)適用性。

利用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化組培配方營(yíng)養(yǎng)元素配比問(wèn)題也不少。首先，在網(wǎng)址http://www.math.hkbu.edu.hk/UniformDesign/上選擇均勻設(shè)計(jì)表時(shí)，同因素同水平不要選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)最少的設(shè)計(jì)表格，雖然最小設(shè)計(jì)表可以減少一定工作量，但在后續(xù)回歸方程擬合時(shí)容易產(chǎn)生信息流失，影響方程擬合效果。本實(shí)驗(yàn)采用U11(114)表，雖然擬合出優(yōu)良方程，建議用D(偏差值)更小、均勻度更好的U14(144)、U16(164)甚至U22(224)均勻表，這樣更具科學(xué)性。第二，與一元一次方程相比，多元二次回歸方程求解可能存在多個(gè)結(jié)果，必須通過(guò)試驗(yàn)逐個(gè)檢驗(yàn)。如本試驗(yàn)得到回歸方程Y=2.224[Ca(NO3)2·4 H2O]2+1.881[NH4NO3][Ca(NO3)2·4 H2O]-2.286[NH4NO3] [KNO3]-1.1[Ca(NO3)2·4 H2O] [MgSO4]+1.077[KNO3]+0.861[MgSO4·7 H2O]-2.98[Ca(NO3)2·4 H2O]+0.693，進(jìn)行最優(yōu)解時(shí)，還可以得到[Ca(NO3)2·4 H2O]282.4 mg·L-1+[NH4NO3]433.5 mg·L-1+[KNO3]155.7 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]534.7 mg·L-1，這與3-1配方差別較大，必須將鈣果4號(hào)莖段試管苗接入進(jìn)行檢驗(yàn)，得到最終結(jié)果：[Ca(NO3)2·4 H2O]340.4 mg·L-1+[NH4NO3]500.2 mg·L-1+[KNO3]9.3 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]567.9 mg·L-1+[KH2PO4]85 mg·L-1。