孔 瓊，王傳銘，汪斌偉，張曉媛，李 珣，謝 昆，舒 茜，黃鏡梅，袁盛勇

(紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自 661199)

【研究意義】南瓜實(shí)蠅[Bactroceratau(Walker)]是一種重要的農(nóng)業(yè)檢疫性害蟲(chóng)，分布于東南亞和南太平洋地區(qū)[1]，而中國(guó)主要分布于東南沿海、華中、華南、西南等地區(qū)。寄主范圍廣，能危害16個(gè)科80多種植物，尤其是果蔬類(lèi)作物，會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前該蟲(chóng)仍以化學(xué)防治為主，帶來(lái)一系列不良后果，如環(huán)境污染加重、果蔬農(nóng)藥殘留超標(biāo)和害蟲(chóng)易產(chǎn)生抗藥性等[2-4]。所以，基于嗅覺(jué)靶標(biāo)的防治策略制定具有重要意義，即通過(guò)調(diào)控其覓食、產(chǎn)卵等行為進(jìn)行害蟲(chóng)防治是一個(gè)重要的研究方向，開(kāi)發(fā)綠色、環(huán)保、安全的新型昆蟲(chóng)行為干擾劑，并為南瓜實(shí)蠅的后期相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感受器是昆蟲(chóng)感受外界揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的特異感受系統(tǒng)，昆蟲(chóng)通過(guò)該系統(tǒng)感知和識(shí)別氣味分子，并將其轉(zhuǎn)化為電生理信號(hào)，從而調(diào)控昆蟲(chóng)對(duì)外界信息化學(xué)物質(zhì)做出反應(yīng)，如取食、交配、產(chǎn)卵及躲避敵害等行為[5-6]。而這一序列過(guò)程，需要多種蛋白參與，包括氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、化學(xué)感受態(tài)蛋白(chemosensory proteins，CSPs)、氣味受體蛋白(odorant receptors，ORs)、氣味降解酶(odorant degrading esterase，ODEs) 、離子型受體(ionotropic receptors，IRs) 以及感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白 (sensory neuron membrane proteins，SNMPs)等，且每種蛋白都不可替代，發(fā)揮著重要作用[7-8]。其中OBPs是氣味分子和受體間的橋梁，起到識(shí)別并運(yùn)輸氣味分子，激活受體，降解和保護(hù)等主要功能，在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)通訊中具有重要作用[7,9]。目前，氣味結(jié)合蛋白(OBPs)在多種昆蟲(chóng)中被鑒定出來(lái)，如鱗翅目稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)[10]、大蠟螟(Galleriamellonella)[11]、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)[12]；直翅目亞洲小車(chē)蝗(Oedaleusasiaticus)[13]、沙漠蝗(Schistocercagregaria)[14]；鞘翅目馬鈴薯甲蟲(chóng)(Leptinotarsadecemlineata)[15]、云南切梢小蠹(Tomicusyunnanensis)[16]；膜翅目斑痣懸繭蜂(Meteoruspulchricornis)[17]；雙翅目柑橘大實(shí)蠅(Bactroceraminax)[18]、斑翅果蠅(Drosophilasuzukii)[19]；半翅目麥長(zhǎng)管蚜(Sitobionavenae)[20]等。雖然OBPs是一類(lèi)低分子量的水溶性蛋白，且具有相似的結(jié)構(gòu)，但不同種昆蟲(chóng)其OBPs數(shù)量和組織表達(dá)差異較大[21]。【本研究切入點(diǎn)】前人關(guān)于實(shí)蠅科害蟲(chóng)桔小實(shí)蠅(B.dorsalis)、柑橘大實(shí)蠅(B.minax)、瓜實(shí)蠅(B.cucurbitae)等的OBPs鑒定、特征、組織表達(dá)及功能研究較多[18,22-23]，而南瓜實(shí)蠅(B.tau)的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)南瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組庫(kù)和NCBI搜尋氣味蛋白基因，對(duì)南瓜實(shí)蠅OBPs基因的cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆和分析，并采用半定量RT-PCR檢測(cè)不同OBPs基因在其組織中的表達(dá)情況，以期明確南瓜實(shí)蠅OBPs 基因的特性、表達(dá)情況，為南瓜實(shí)蠅的后續(xù)相關(guān)研究和揭示昆蟲(chóng)嗅覺(jué)反應(yīng)機(jī)制提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蟲(chóng)源：南瓜實(shí)蠅采用人工飼養(yǎng)3代以上的實(shí)驗(yàn)室種群。成蟲(chóng)于26 ℃，相對(duì)濕度(75±10)%，光周期L∶D=14 h∶10 h下進(jìn)行飼養(yǎng)。

主要試劑：Trizol 購(gòu)自 Invitrogen公司；通用型RNA提取試劑盒(R4130-02)購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、載體 pMD18-T和TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自 TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HB181210)、Hieff?PCR Master Mix、三氯甲烷、瓊脂糖、無(wú)水乙醇、DL2000 DNA Marker、loading buffer等一些常用試劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 南瓜實(shí)蠅OBP基因的克隆

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果注釋篩選獲得6條南瓜實(shí)蠅OBP基因，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增OBPs全長(zhǎng)和RT-PCR的所用引物(表1)，引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 南瓜實(shí)蠅不同組織的RNA采用通用型RNA試劑盒提取，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，獲得cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆茫蛑苯佑糜诳寺』騌T-PCR。

1.2.3 南瓜實(shí)蠅OBP基因的克隆與鑒定 以cDNA為模板進(jìn)PCR擴(kuò)增，克隆OBPs的全長(zhǎng)。體系為50 μL，組成為模板cDNA 2 μL、PCR Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、50～58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，其中退火溫度根據(jù)引物不同進(jìn)行微調(diào)。將鑒定后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后，挑起陽(yáng)性單克隆菌株送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用DNASTAR 7.1軟件中的SeqMan工具進(jìn)行拼接分析，獲得完整的基因編碼區(qū)序列。

1.2.4 南瓜實(shí)蠅OBPs序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 利用在線程序ExPASy ProtParam獲得OBPs編碼氨基酸的數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)等信息；再通過(guò)在線程序Open Reading Frame Finder預(yù)測(cè)OBPs序列的開(kāi)放閱讀框；用Vector NTI計(jì)算序列間的相似度；同時(shí)用SignalP 4.1在線軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用TMHMM工具分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)；運(yùn)用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行序列相似性搜索；采用MEGA 6.0軟件的neighbor-joining(NJ)法(Bootsrap1000次)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

表1 南瓜實(shí)蠅OBPs 基因鑒定和組織表達(dá)分布所用引物

1.3 南瓜實(shí)蠅雌、雄蟲(chóng)中OBPs的組織表達(dá)分析

以南瓜實(shí)蠅雌、雄蟲(chóng)不同組織的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參照基因，用表1中的半定量特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系(體積50 μL)為模板cDNA 2 μL、PCR Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL；反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、50～57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜實(shí)蠅OBPs克隆

用設(shè)計(jì)的6對(duì)特異性全長(zhǎng)引物對(duì)南瓜實(shí)蠅OBP基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大小為500～990 bp，與預(yù)測(cè)相符(圖1)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 南瓜實(shí)蠅OBPs序列分析和鑒定

根據(jù)6對(duì)引物的特異性擴(kuò)增和測(cè)序拼接后的序列，并利用 OBPs 保守半胱氨酸(Cys，cysteine)位點(diǎn)的特征序列鑒定南瓜實(shí)蠅OBPs，再利用 PSI-Blast 和關(guān)鍵詞搜索進(jìn)行比對(duì)鑒定，共獲得6個(gè)OBPs，見(jiàn)表2。6個(gè)OBPs基因序列長(zhǎng)度在498～955 bp，編碼的氨基酸數(shù)量為128～314 aa，等電點(diǎn)于4.69～8.16，分子量大小為14.67～36.24 kDa，且每個(gè)OBP序列的N端均有具有16～26 aa組成的信號(hào)肽序列。其中OBP1編碼314個(gè)氨基酸為超長(zhǎng)鏈，相比其他的OBPs要長(zhǎng)149～223 aa，而OBP2、OBP9、OBP11和OBP14為長(zhǎng)鏈，編碼的氨基酸分別為165、154、148和148個(gè)，OBP8則為中鏈，編碼128 aa。

同時(shí)根據(jù)OBPs保守Cys殘基數(shù)目和多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)南瓜實(shí)蠅OBPs具有典型的保守結(jié)構(gòu)域，其中OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14等5個(gè)屬于Classica型，均含有6個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)；而OBP8的第2、5個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)被其他氨基酸代替，在分類(lèi)上屬于Minus型(圖2)。

2.3 南瓜實(shí)蠅OBPs的進(jìn)化分析

通過(guò)南瓜實(shí)蠅6個(gè)OBPs序列間的相似度對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不同序列間的相似性較低為30%～51%(表3)。其中OBP8和OBP9的氨基酸序列相似性最高達(dá)51%；OBP11和OBP14次之，為49%；OBP2和OBP9、OBP8和OBP11較低為40%；OBP1和OBP11的相似性最低為30%，表明6個(gè)南瓜實(shí)蠅OBPs在一定程度上具有同源性，也存在著較強(qiáng)的分化差異。

表2 南瓜實(shí)蠅OBPs基因序列分析

表3 南瓜實(shí)蠅6個(gè)OBP氨基酸序列的相似性

為了明確南瓜實(shí)蠅OBP與其他近緣種的進(jìn)化關(guān)系，以南瓜實(shí)蠅OBPs氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并選取比對(duì)結(jié)果相似性大于70%且與南瓜實(shí)蠅OBPs相近的12種雙翅目實(shí)蠅科昆蟲(chóng)共48個(gè)OBPs進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(圖3)。由圖3可知，6個(gè)南瓜實(shí)蠅OBP分布在其他實(shí)蠅科昆蟲(chóng)的OBPs分枝上，沒(méi)有特化形成單一分枝。其中OBP1、OBP2、OBP14聚于同一大進(jìn)化分枝，又分別聚于不同的小進(jìn)化枝(OBP1、OBP2聚于同一進(jìn)化枝，OBP14單獨(dú)為另一枝)，3個(gè)均為Classic型；OBP11單獨(dú)分布在另一進(jìn)化枝上，屬于Classic 型；而OBP8、OBP9聚類(lèi)在同一大類(lèi)的進(jìn)化分枝上，但是又分別聚于不同小進(jìn)化枝上，且OBP9是Classic型，而OBP8是Minus型，結(jié)果表明它們之間具有一定的同源性，但又存在分化。與其他雙翅目昆蟲(chóng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，6個(gè)南瓜實(shí)蠅OBPs與瓜實(shí)蠅(Zeugodacuscucurbitae)的OBPs親緣關(guān)系較近，柑橘大實(shí)蠅(B.minax)次之；雖然不同OBPs之間分化程度明顯，但相同OBPs亞家族仍然聚類(lèi)到同一進(jìn)化枝，表明其在進(jìn)化過(guò)程中仍具有同源性。

2.4 南瓜實(shí)蠅雌、雄蟲(chóng)中OBPs的組織表達(dá)情況

采用半定量PCR對(duì)6個(gè)OBPs基因在南瓜實(shí)蠅的不同性別、成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，從圖4可看出，除OBP14在雄蟲(chóng)腹部組織不表達(dá)，且在雌蟲(chóng)頭、足和腹部表達(dá)較少外，其余5個(gè)OBPs在雌、雄蟲(chóng)的不同組織中均有分布和表達(dá)。其中OBP1在雌雄蟲(chóng)的不同組織中均有表達(dá)和分布且表達(dá)量相對(duì)一致，OBP2在雄蟲(chóng)的觸角、頭、足和腹部組織中表達(dá)量相對(duì)較高且一致，而OBP8則在雌蟲(chóng)的觸角、頭、足和腹部組織中高度表達(dá)且量相對(duì)一致。因此OBP1、OBP2、OBP8、OBP9、OBP11 5個(gè)OBPs在雌、雄蟲(chóng)的觸角、頭、足和腹部等組織中廣泛分布，而OBP11、OBP14均在雌、雄蟲(chóng)觸角中高度表達(dá)。

3 討 論

前人研究發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)OBPs是一類(lèi)水溶性的小分子蛋白，不同昆蟲(chóng)其體內(nèi)鑒定出的數(shù)目多少不等且差異較大，不同屬或種間其氨基酸序列差異較大，并且同一物種下不同OBP間的氨基酸同源性也較低[21,24-25]。如鞘翅目馬鈴薯甲蟲(chóng)(Leptinotarsadecemlineata)鑒定出26個(gè)OBP，編碼氨基酸長(zhǎng)度為67～255 aa，各序列間高度分化，氨基酸序列相似性為3.20%～41.91%[15]；雙翅目中的桔小實(shí)蠅(B.dorsalis)鑒定出49個(gè)OBP[26]；棗實(shí)蠅(Carpomyavesuviana)克隆出7個(gè)OBP，其開(kāi)發(fā)閱讀框長(zhǎng)為372～510 bp，編碼氨基酸長(zhǎng)度為124～170 aa[27]；福建漳州的南亞實(shí)蠅(B.tau，南瓜實(shí)蠅)克隆鑒定出26個(gè)OBP[28]，且與瓜實(shí)蠅(B.cucuribitae)OBPs高度相似；而云南紅河州的南瓜實(shí)蠅(B.tau)僅克隆鑒定出6個(gè)OBP，其編碼的氨基酸長(zhǎng)度為128～314 aa，各序列間高度特化，氨基酸序列相似性?xún)H為3.20%～41.91%，并且不同OBP間其相似性較低為30%～51%，可能與采集地地理環(huán)境不同或者未完全鑒定出OBP有關(guān)，推測(cè)南瓜實(shí)蠅體內(nèi)不同OBPs可能具有不同的生理功能。

根據(jù)OBPs中半胱氨酸殘基位置和數(shù)目的不同，可將昆蟲(chóng)OBPs分為5類(lèi)：①Classical，含有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn);②Minus，常含有4或5個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，其數(shù)目比Classical型少1～2個(gè);③Plus，保守半胱氨酸數(shù)量大于6個(gè)，在第6個(gè)半胱氨酸后至少有2個(gè)額外的半胱氨酸和1個(gè)脯氨酸;④Atypical，含有多于6個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，但N端區(qū)域較為典型，C端區(qū)域較長(zhǎng)且特征不明顯;⑤Dimer，含有2個(gè)典型的半胱氨酸基序聚合在一起形成[25,29-31]。通過(guò)試驗(yàn)鑒定出的6個(gè)南瓜實(shí)蠅OBPs，有5個(gè)是Classical型，分別為OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14，均含有6個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)；1個(gè)(OBP8)是Minus型，該基因的第2個(gè)、第5個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)被其他氨基酸代替。南亞實(shí)蠅(B.tau，南瓜實(shí)蠅)鑒定出的26個(gè)OBPs中Classical型有21個(gè)，Dimer型1個(gè)，Minus型和Plus型各2個(gè)[28]；桔小實(shí)蠅(B.dorsalis)注釋獲得49個(gè)OBPs，其中33個(gè)屬于Classical型，4個(gè)屬于Plus，10個(gè)屬于Minus，僅有2個(gè)屬于Atypical型[26]；棗實(shí)蠅(Carpomyavesuviana)轉(zhuǎn)錄組獲得7個(gè)OBPs，其中5個(gè)是Classical型，其余2個(gè)是Minus型[27]。因此不同科屬或同屬不同種的昆蟲(chóng)體內(nèi)的OBPs數(shù)目、類(lèi)型和比例差異較大。OBPs可在昆蟲(chóng)的不同組織中表達(dá)，如頭、胸、腹、翅、下顎須、喙、口器、性腺、精囊、氣門(mén)等[21]，同時(shí)在昆蟲(chóng)的唾液中也有表達(dá)[31]。但同種昆蟲(chóng)OBP在不同性別的成蟲(chóng)組織中表達(dá)量差異較大[9,21]，本文研究也有類(lèi)似的結(jié)果，即南瓜實(shí)蠅(B.tau)的5個(gè)OBP1、OBP2、OBP8、OBP9、OBP11在雌、雄蟲(chóng)的觸角、頭、足和腹部等組織中廣泛分布，而OBP14在雌蟲(chóng)的腹部不表達(dá)，因此腹部可能不是南瓜實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白作用的重要部位。

通過(guò)鑒定獲得6個(gè)南瓜實(shí)蠅OBP及其相關(guān)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，但這些基因在蟲(chóng)體內(nèi)的作用，還需進(jìn)一步進(jìn)行表達(dá)和純化，并采用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、免疫組學(xué)、亞細(xì)胞定位及RNA沉默[32]等試驗(yàn)對(duì)OBP的具體功能深入研究，才能為開(kāi)發(fā)南瓜實(shí)蠅綠色、有效引誘劑提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為后期研究南瓜實(shí)蠅的嗅覺(jué)功能提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

克隆并鑒定出的6個(gè)南瓜實(shí)蠅OBPs基因，長(zhǎng)度介于498～955 bp，編碼128～314 aa，其中OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14屬于Classic型，而OBP8屬于Minus型，且6個(gè)OBPs分化明顯，相似度為30%～51%；6個(gè)OBPs在雌、雄蟲(chóng)不同組織中均有表達(dá)，而OBP14在雄蟲(chóng)腹部不表達(dá)，OBP15在雌蟲(chóng)腹部不表達(dá)。數(shù)據(jù)的獲得將為進(jìn)一步研究南瓜實(shí)蠅嗅覺(jué)識(shí)別分子機(jī)制和引誘機(jī)制奠定基礎(chǔ)。