李蔣偉，周 力，侯生珍，王志有，雷 云，賈建磊，桂林生

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

【研究意義】腸道微生物對(duì)機(jī)體健康的影響機(jī)制是近年來研究的一大熱點(diǎn)，真菌在腸道菌群中相較于細(xì)菌占比較小，但是對(duì)維持腸道生態(tài)平衡發(fā)揮了重要作用[1]。目前腸道真菌與宿主間的互益關(guān)系并未有力證據(jù)被證明，而除了少數(shù)具有益生作用的真菌之外，腸道真菌多為致病菌，大量學(xué)者研究表明腸道真菌對(duì)炎癥性腸病、腹瀉等疾病有重要影響[2-4]。但對(duì)于反芻動(dòng)物來說，真菌有利于挖掘高效纖維降解酶，而畜種、消化道類型和日糧結(jié)構(gòu)等因素均能影響消化道真菌的組成。許多研究者發(fā)現(xiàn)草食動(dòng)物消化道中存在大量好氧真菌,無論這些真菌是一過性還是長(zhǎng)期定殖,它們?cè)谙乐卸夹惺沽艘欢ǖ睦w維消化功能，且酵母綱所占比例高,具有潛在開發(fā)價(jià)值[6-8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ISHAQ等[9]利用WHITE等[10]的引物擴(kuò)增ITS1序列,通過高通量分析發(fā)現(xiàn)在奶牛瘤胃中存在著近50%的非嚴(yán)格厭氧真菌；當(dāng)奶牛日糧精粗比升高誘導(dǎo)亞臨床酸中毒后,奶牛瘤胃中新美鞭菌屬、根囊鞭菌屬、梨囊鞭菌屬厭氧真菌的相對(duì)豐度顯著降低，而翹孢霉屬 (Emericella) 、鐮刀菌屬 (Fusarium) 、紅曲霉屬(Monascus) 、畢赤酵母屬 (Pichia) 、假絲酵母 (Candida) 等相對(duì)豐度有增加趨勢(shì)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ITS高通量測(cè)序技術(shù)利用其在不同菌種中序列的多樣性進(jìn)而鑒定菌種的類別[11]，而使用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定不同精粗比日糧對(duì)藏羊腸道真菌微生物菌群分布鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)旨在探究早期斷奶藏羔羊育肥期日糧適宜的精粗配比，測(cè)定藏羊腸道真菌微生物分布特征，分析不同精粗比真菌菌群定植的影響，為藏羊日糧的合理配制和科學(xué)飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

2019年5月15日至8月25日，在青海省海南州共和縣切吉鄉(xiāng)哇合村青海香咔梅朵牧業(yè)有限公司進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)；2019年9月16日腸道食靡樣品交由百邁克生物科技公司進(jìn)行真菌16S rDNA基因的測(cè)序工作。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

選擇健康、體況相近的早期斷奶藏羊母羔共210只，隨機(jī)分成7組，每組30只。7組羔羊分別飼喂精粗比為80∶20(A組)、70∶30(B組)、60∶40(C組)、50∶50(D組)、40∶60(E組)、30∶70(F組)和20∶80(G組)的日糧；日糧精粗比為干物質(zhì)比，各組精飼料完全一致，粗飼料由燕麥青干草與燕麥青貯按干物質(zhì)比例1∶1混合而成。飼養(yǎng)試驗(yàn)預(yù)飼期為10 d，正試期為90 d。藏羊未有現(xiàn)行飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，參考NY/T 816—2004中國(guó)肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行日糧配制，精飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羔羊全舍飼分欄飼養(yǎng)，分別于早晨8：30和下午16：30飼喂羔羊2次，日糧自由采食，自由飲水，每天飼喂前清掃殘留飼料并稱重。每天中午12：30定期清掃羊舍，保持羊舍衛(wèi)生、通風(fēng)和干燥，每周對(duì)羊舍和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)進(jìn)行2次消毒殺菌。試驗(yàn)期對(duì)羔羊進(jìn)行羊四聯(lián)、小反芻獸、口蹄疫和羊痘等疫苗的免疫注射，分別用伊維菌素和溴氰菊酯淋浴進(jìn)行內(nèi)外寄生蟲防治。

表1 精飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 腸道食靡采集與真菌分析方法

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每組中隨機(jī)抽取3只試驗(yàn)羊于清晨空腹屠宰，采集小腸食靡于5 mL離心管中，混勻、過濾后將濾液進(jìn)行3500 r/min離心15 min，投入液氮，于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冷凍保存。本試驗(yàn)16SrDNA高通量測(cè)序部分交由百邁客生物科技有限公司測(cè)定，對(duì)采集到的21個(gè)腸道食靡樣品基于 Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，采用雙末端測(cè)序(Paired-End)的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步對(duì) Reads 拼接過濾，OTUs聚類分析，物種注釋及豐度分析。使用DNA提取試劑盒(InvitrogenTM，USA)提取瘤胃微生物基因組DNA，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，真菌通用引物為ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATC GATGC-3′。在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，進(jìn)而得到原始圖像數(shù)據(jù)文件。PCR擴(kuò)增步驟為：模板DNA經(jīng)加熱至98 ℃左右持續(xù) 2 min，輪回30次循環(huán)，依次經(jīng)過98 ℃×30 s、50 ℃×30 s、72 ℃×1 min，最后于72 ℃下延長(zhǎng)7 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel整理初始數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0中的One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，檢測(cè)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)的形式表示。差異顯著的評(píng)斷標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧精粗比對(duì)育肥藏羊腸道真菌微生物的影響

2.1.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 參與測(cè)序21個(gè)育肥藏羊腸道食靡樣品共產(chǎn)生1524 066條Clean tags，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生67 257條Clean tags，平均產(chǎn)生72 575條Clean tags。所有樣品測(cè)序覆蓋率均在99%以上，本試驗(yàn)測(cè)序深度能夠準(zhǔn)確反映藏羊瘤胃細(xì)菌的組成。

從圖1可以看出，在97%的物種相似度水平下，7組檢測(cè)樣本共得到499個(gè)OTU，其中有351個(gè)為7組共有OTU，占OTU總數(shù)比例的70.3%，獨(dú)有的OTU分別為12、15、10、11、76、6和18個(gè)，占總的OTU數(shù)較小，表明各組之間(除E組外)OTU組成差異較小，相似度較高；其中E組腸道真菌特有OTU最高，有76個(gè)；G組次之，有18個(gè)；F組特有OTU最少，有6個(gè)。

Rank-Abundance曲線可解釋7組樣品多樣性的豐富程度和均勻程度，在橫軸上的寬度代表物種豐富程度，曲線的形狀則表示物種的均勻程度，曲線平坦，表示樣品中腸道真菌微生物均勻度較高。如圖2可以看出，每條曲線對(duì)應(yīng)一個(gè)樣品，用不同顏色標(biāo)記。E組曲線最寬，C組最窄，各組曲線平坦程度相當(dāng)。

2.1.2 日糧精粗比對(duì)真菌阿爾法多樣性的影響 Alpha多樣性分析可以反映測(cè)定樣品瘤胃微生物群落豐富度和多樣性，其中Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)越大表明群落豐富度越大；Simpson指數(shù)越大反映群落多樣性越低；Shannon指數(shù)越大群落多樣性越高。由表2可知，E組Shannon指數(shù)顯著高于B、C組(P<0.05)；B、C組Simpson指數(shù)顯著高于其余各組(P<0.05)；B組ACE指數(shù)顯著高于其余各組(P<0.05)；Chaol指數(shù)中F組顯著高于其余各組(P<0.05)。

2.2 不同精粗比日糧對(duì)藏羊腸道真菌分布的影響

2.2.1 門水平下真菌分布分析 由表3可知，子囊菌門是各處理組的優(yōu)勢(shì)菌門，占腸道真菌比例超過34%，且C、D和F組顯著高于A、B組(P<0.05)；擔(dān)子菌門是次優(yōu)菌門，且B組顯著高于其余各組(P<0.05)；被孢霉菌門A、B組顯著高于其余處理組(P<0.05)；捕蟲霉亞門各組之間無顯著性差異(P>0.05)。

表2 阿爾法多樣性指數(shù)表

表3 門水平下真菌相對(duì)含量

2.2.2 科水平下腸道真菌菌群分布分析 由表4可知，被孢霉菌科為藏羊腸道真菌中優(yōu)勢(shì)菌科，最高占比超過18%，且A、B組中占比較高(P<0.05)；絲孢酵母菌科C、D組顯著高于其余各組(P<0.05)；黏毛菌科則在低精料處理組(F和G組)中分布較廣(P<0.05)；酵母菌科則B組顯著高于其余各組(P<0.05)；G組中紅菇科相較其他處理組有較多分布(P<0.05)。

3 討 論

3.1 日糧精粗比對(duì)藏羊腸道真菌豐度的影響

許多學(xué)者研究表明，真菌在腸道所占比例較小，但對(duì)于腸道菌群穩(wěn)態(tài)平衡至關(guān)重要[13]。腸道菌群通過影響某些營(yíng)養(yǎng)素、激素和維生素的合成和代謝，通過清除藥物和有毒代謝物，為維持宿主健康作出了巨大貢獻(xiàn)；除此之外，真菌還可以通過促進(jìn)宿主免疫系統(tǒng)中免疫細(xì)胞的發(fā)育和成熟來抵御病原體[14-15]。除此之外，腸道真菌同細(xì)菌關(guān)系緊密，它們穩(wěn)定的拮抗、互利共生等關(guān)系是腸道微生物處于穩(wěn)態(tài)平衡的根本。有學(xué)者運(yùn)用ITS1序列，對(duì)以牛科、鹿科和長(zhǎng)頸鹿科等為代表的反芻動(dòng)物與袋鼠科、偽反芻動(dòng)物駱駝科和河馬科前胃發(fā)酵非反芻動(dòng)物，以及馬科、美洲鬣蜥科和犀科等后腸發(fā)酵動(dòng)物(共29種)的糞便中厭氧真菌組成進(jìn)行了系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)厭氧真菌的OTU數(shù)在4種發(fā)酵類型的動(dòng)物糞便中無顯著差異，但在后腸發(fā)酵動(dòng)物糞便中的厭氧真菌組成明顯有別于前胃發(fā)酵類型[16]。本試驗(yàn)對(duì)藏羊飼以不同精粗比的日糧后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)精粗比為40∶60時(shí)，腸道真菌OTU數(shù)量最多，而其余處理組OUT數(shù)量差別不大，且真菌群落豐富度與多樣性與其他處理組相比均較好；試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)藏羊日糧中添加適量的粗飼料可以有效促進(jìn)其腸道真菌定植與代謝。

3.2 日糧精粗比對(duì)藏羊腸道真菌物種分布的影響

通常認(rèn)為，反芻動(dòng)物消化道門水平下真菌具有解聚復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)的能力，例如降解木質(zhì)纖維素生物量、提高動(dòng)物飼料消化率、生產(chǎn)沼氣、生物乙醇和其他各種功能[17-19]。Avijit Dey等[20-21]給反芻動(dòng)物直接飼喂厭氧真菌培養(yǎng)物發(fā)現(xiàn)，厭氧真菌可以提高其采食量、乳質(zhì)量和乳產(chǎn)量等。近年來，許多學(xué)者利用真菌通用引物在反芻動(dòng)物消化道內(nèi)發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了越來越多的非嚴(yán)格厭氧真菌，其中包括子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門等，瘤胃中子囊菌門相對(duì)豐度更高，可高達(dá)22.6%[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)子囊菌門、擔(dān)子菌門在藏羊腸道也廣泛存在，且豐度分別超過了34%和8%；除此之外被孢霉菌門的相對(duì)豐度在藏羊腸道中也不可忽視，豐度超過4%；說明日糧精粗比例并不會(huì)改變藏羊腸道優(yōu)勢(shì)菌群種類，但對(duì)其豐度有較大影響。

表4 科水平下真菌相對(duì)含量

酵母菌是具有龐大的家族系統(tǒng)的兼性厭氧型真菌，種類達(dá)1000多種，是子囊菌門中的重要成員，其培養(yǎng)物作為一種安全環(huán)保的飼料添加劑，受到飼料生產(chǎn)者和研究者的重視；大量研究表明飼喂活酵母可促進(jìn)瘤胃微生物數(shù)量和活力，改善產(chǎn)肉和產(chǎn)奶性能[23]。Williams PE等[24]研究表明,高精料日糧飼喂奶牛，活酵母可以加速瘤胃乳酸代謝，調(diào)控瘤胃pH值至穩(wěn)定狀態(tài)；除此之外，飼喂活酵母可改善瘤胃的發(fā)酵特性，增強(qiáng)瘤胃微生物對(duì)纖維飼料的定殖，進(jìn)而提高微生物對(duì)纖維飼料的降解能力[25]?？芑劬闧26]在研究酵母培養(yǎng)物對(duì)羔羊的影響發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加20 g/kg酵母培養(yǎng)物可以顯著提高羔羊瘤胃內(nèi)羧甲基纖維酶活性，同時(shí)促進(jìn)羔羊瘤胃發(fā)育，也有利于維持瘤胃乳頭的正常形態(tài)，在高精料飼糧中效果更為明顯。李娜等[27]研究表明舍飼條件下灘羊羔羊瘤胃中釀酒酵母的含量高于放牧組羔羊，說明增加精料比例可以促進(jìn)釀酒酵母在2月齡灘羊瘤胃內(nèi)的定植。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)精粗比為70∶30時(shí)，酵母菌科相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于其他處理組，而其余處理組之間酵母菌科相對(duì)豐度無較大差距。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，藏羊腸道優(yōu)勢(shì)菌群為子囊菌門和擔(dān)子菌門；當(dāng)日糧精粗比例為40∶60時(shí)，藏羊腸道真菌微生物多樣性及豐富度較好；適量的精料可促進(jìn)酵母菌科生長(zhǎng)，精粗比在70∶30時(shí)酵母菌科相對(duì)豐度最高，但過高的精粗比例會(huì)抑制該菌生長(zhǎng)。綜合上述結(jié)果，精粗比為40∶60時(shí)更適合藏羊腸道真菌定植及結(jié)構(gòu)構(gòu)建。