孫 妍，陳思宇，肖 健，宋靜靜，楊尚東*

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/植物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，廣西 南寧 530004；2.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西 欽州 535011)

【研究意義】番茄(SolanumlycopersicumL.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜之一，含有豐富的有機(jī)酸、糖、礦物質(zhì)、谷胱甘肽、番茄紅素和多種維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，有清除自由基、美白和延緩衰老等功效[1]。我國(guó)是世界上最大的番茄生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，種植番茄已成為我國(guó)部分農(nóng)村的脫貧致富途徑[2]。番茄果實(shí)形狀是指示番茄品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是番茄果實(shí)分級(jí)和育種的重要指標(biāo)[3]。同時(shí)，隨著番茄采摘機(jī)器人研發(fā)的不斷深入，控制影響番茄果實(shí)形狀的因子正日益受到廣大科技人員的重視[4]。植物內(nèi)生菌是能存活在植物各組織和器官內(nèi)、與宿主植物關(guān)系和諧互利的一類(lèi)微生物[5-6]，具有促進(jìn)宿主新陳代謝、防蟲(chóng)防病、固氮、固磷和增強(qiáng)植株抗性等生物學(xué)作用[7-8]，但對(duì)番茄品質(zhì)尤其是果實(shí)形狀方面的影響尚不清楚。因此，解析果實(shí)形狀不同番茄品種植株莖部的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，探究?jī)?nèi)生細(xì)菌與果實(shí)形狀間的相關(guān)性，對(duì)構(gòu)建新型番茄育種評(píng)價(jià)技術(shù)體系具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Rodriguez等[9]利用Tomato analyzer可將番茄果實(shí)形狀分為扁平、矩形、橢圓形、牛心形、圓形、倒卵形、心形和長(zhǎng)形，并發(fā)現(xiàn)SUN、OVATE、FAS和LC4個(gè)基因?qū)麑?shí)形狀具有重要影響。番茄果實(shí)形狀除受基因調(diào)控外，還受外界環(huán)境、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)水平、激素及病蟲(chóng)害等諸多因素的綜合影響[10-13]，如鉀元素不僅有助于番茄果實(shí)均勻著色，還有助于減少果實(shí)表面黃斑和畸形果[3]，磷在番茄果實(shí)孕育中發(fā)揮著重要作用[14]。此外，在番茄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，植物激素尤其是生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GA)、乙烯、脫落酸(ABA)和細(xì)胞分裂素(CK)也發(fā)揮著重要作用，如IAA通過(guò)刺激果皮細(xì)胞分裂觸發(fā)番茄坐果，且IAA濃度在果實(shí)中心部位最高，明顯高于其他果實(shí)部位[15-16]；ABA可通過(guò)抑制乙烯的產(chǎn)生促進(jìn)果皮細(xì)胞擴(kuò)張，正向調(diào)控番茄細(xì)胞生長(zhǎng)；GA處理可啟動(dòng)果實(shí)發(fā)育功能，提高番茄果實(shí)坐果率，還可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂使果實(shí)膨大[17]；ABA通過(guò)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉參與受寒冷和干旱脅迫植物的響應(yīng)機(jī)制[18]；CK可激活花前子房的細(xì)胞分裂并導(dǎo)致單性結(jié)實(shí)，調(diào)節(jié)果實(shí)生長(zhǎng)[19]。Kumar等[16]研究還發(fā)現(xiàn)，SIIAA9基因表達(dá)的變化伴隨著乙烯相關(guān)基因表達(dá)的大量變化，乙烯通過(guò)與IAA進(jìn)行協(xié)調(diào)作用參與果實(shí)坐果過(guò)程，因此內(nèi)源激素IAA和乙烯含量水平對(duì)番茄結(jié)實(shí)的誘導(dǎo)至關(guān)重要；ABA合成減少、分解代謝增加或敏感性降低會(huì)導(dǎo)致植物氣孔關(guān)閉失敗，果實(shí)缺乏ABA會(huì)導(dǎo)致蒸騰作用增加，水分虧缺，抑制果實(shí)生長(zhǎng)。已有研究證實(shí)，IAA[20]、CK[21]、ABA[22]、GA[23]和乙烯[24]等植物內(nèi)源激素的產(chǎn)生與植物內(nèi)生菌緊密相關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】雖然前人對(duì)番茄果實(shí)形狀的形成開(kāi)展了相關(guān)研究，但目前關(guān)于植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)番茄果色、果形和果實(shí)甜度等果實(shí)品質(zhì)影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，特別是針對(duì)影響果實(shí)形狀形成特有內(nèi)生菌屬的研究仍缺乏直接證據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】比較分析4種果實(shí)形狀番茄品種植株莖部的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及代謝功能特征，探究番茄果實(shí)形狀形成與植株內(nèi)生細(xì)菌的關(guān)聯(lián)性，為構(gòu)建番茄育種新型評(píng)價(jià)體系及有益微生物功能的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2020年3—6月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜基地(東經(jīng)108°17′25″，北緯22°51′02″)設(shè)施大棚內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)地土壤理化性質(zhì)：pH 5.68，有機(jī)質(zhì)8.92 g/kg，全氮0.55 g/kg，全磷0.67 g/kg，全鉀7.51 g/kg，堿解氮15.27 mg/kg，速效磷0.67 mg/kg，速效鉀82.8 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

供試橢圓形番茄品種為千禧(E)(臺(tái)灣農(nóng)友種苗公司)，扁平形番茄品種為桃太郎(F)(日本瀧井種苗株式會(huì)社)，長(zhǎng)型番茄品種為鳳珠(L)(臺(tái)灣農(nóng)友種苗公司)，圓球形番茄品種為愛(ài)麗(R)(日本瀧井種苗株式會(huì)社)。所有品種均同期育苗、定植及進(jìn)行常規(guī)栽培管理。番茄進(jìn)入果實(shí)成熟期時(shí)進(jìn)行樣品采集。每個(gè)品種選取3株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，使用經(jīng)消毒的鐵鏟和剪刀隨機(jī)采集莖部樣品，送樣檢測(cè)植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品總DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定 利用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，U.S)抽提總DNA，使用NanoDrop2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，U.S)測(cè)定DNA濃度和純度，最后凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。細(xì)菌16S rRNA基因V5～V7高變區(qū)PCR擴(kuò)增引物為799F：5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′和1193R：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′；進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定、純化及定量。Illumina MiSeq測(cè)序：以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收、純化(Extraction Kit)、Tris-HCl洗脫和電泳檢測(cè)，并用QuantusTMFluorometer (Promega，USA)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序[25]。

1.3.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法 利用Uparse平臺(tái)對(duì)優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，去除無(wú)重復(fù)的單序列，按照97%相似性對(duì)序列進(jìn)行分類(lèi)操作單元(OTU)聚類(lèi)，得到OTU的代表序列，生成OTU表格。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，對(duì)比Silva數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落物種組成。

本研究以Shannon與Simpson指數(shù)表征細(xì)菌群落多樣性，以Chao1和Ace指數(shù)指示細(xì)菌群落豐富度，以覆蓋率反映細(xì)菌群落的覆蓋度。利用R語(yǔ)言工具制作群落柱形圖進(jìn)行分類(lèi)水平上優(yōu)勢(shì)物種組成和相對(duì)豐度分析；制作Venn圖統(tǒng)計(jì)分析樣本中所共有和特有的物種OTUs數(shù)，以深入了解番茄莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)特征；利用PICRUSt對(duì)16S rRNA基因V5～V7高變區(qū)擴(kuò)增序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，獲得Pathway的2個(gè)水平信息及各功能類(lèi)別的豐度表。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019和SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-sanger云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)在線(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的OTUs聚類(lèi)分析結(jié)果

由表1可知，在97%相似度水平對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，從4種果實(shí)形狀番茄的植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌中共鑒定到31門(mén)84綱206目347科655屬1045種1660個(gè)OTU。其中，橢圓形番茄(E)莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落由28門(mén)57綱155目269科473屬701種993個(gè)OTU組成；扁平形番茄(F)莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落由24門(mén)55綱148目250科447屬660種951個(gè)OTU組成；長(zhǎng)形番茄(L)莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落由26門(mén)62綱158目267科468屬685種977個(gè)OTU組成；圓球形番茄(R)莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落由25門(mén)62綱163目272科483屬723種1057個(gè)OTU組成。

2.2 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的Alpha分析結(jié)果

由表2可知，4種果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的覆蓋率均在98.0%及以上，說(shuō)明樣本測(cè)序數(shù)據(jù)足夠真實(shí)，可反映其內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性；表征細(xì)菌群落多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)間，以及表征豐富度的Chao1和Ace指數(shù)間均無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明4種果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌均具有相似的多樣性和豐富度。

2.3 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的群落組成分析

在門(mén)分類(lèi)水平，不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌(豐度占比大于1.00%)的群落結(jié)構(gòu)極相似，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)均由放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteriota)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)組成(圖1)。其中，橢圓形果實(shí)番茄(E)植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平的豐度占比排序?yàn)榉啪€(xiàn)菌門(mén)(45.22%)>變形菌門(mén)(34.28%)>厚壁菌門(mén)(14.30%)>擬桿菌門(mén)(1.72%)>酸桿菌門(mén)(1.36%)>綠彎菌門(mén)(1.31%)，其他(Others)門(mén)的豐度占比為1.80%；扁平形番茄(F)植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平的豐度占比排序?yàn)樽冃尉T(mén)(46.97%)>放線(xiàn)菌門(mén)(32.32%)>厚壁菌門(mén)(11.79%)>擬桿菌門(mén)(3.32%)>酸桿菌門(mén)(2.04%)>綠彎菌門(mén)(1.17%)，其他(Others)門(mén)的豐度占比為2.39%；長(zhǎng)形番茄(L)植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平的豐度占比排序?yàn)樽冃尉T(mén)(48.15%)>放線(xiàn)菌門(mén)(34.96%)>厚壁菌門(mén)(11.28%)>酸桿菌門(mén)(1.27%)>擬桿菌門(mén)(1.19%)>綠彎菌門(mén)(1.17%)，其他(Others)門(mén)的豐度占比為1.98%；圓球形番茄(R)植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平的豐度占比排序?yàn)榉啪€(xiàn)菌門(mén)(49.28%)>變形菌門(mén)(28.53%)>厚壁菌門(mén)(15.13%)>酸桿菌門(mén)>(1.76%)>綠彎菌門(mén)(1.74%)>擬桿菌門(mén)(1.34%)，其他(Others)門(mén)的豐度占比為2.23%。

表1 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌在不同分類(lèi)水平的數(shù)量

表2 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)比較

圖1 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平的相對(duì)豐度占比比較Fig.1 Comparison of the relative abundance of dominant endophytic bacteria in stems of tomato plant with different fruit shapes at phylum level

圖2 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬分類(lèi)水平的相對(duì)豐度比較Fig.2 Comparison of the relative abundance of dominant endophytic bacteria in stems of tomato plant with different fruit shapes at genus level

在屬分類(lèi)水平，不同果實(shí)形狀番茄植株莖部共有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬(豐度占比大于1.00%)均為青枯菌屬(Ralstonia)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、短頸細(xì)菌屬(Brevibacterium)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和紅球菌屬(Rhodococcus)(圖2)。其中，青枯菌屬在果實(shí)長(zhǎng)

表3 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬分類(lèi)水平的相對(duì)豐度占比比較

形番茄植株莖部的細(xì)菌屬中的豐度占比達(dá)32.83%，而在橢圓形番茄、圓球形番茄和扁平形番茄植株莖部的細(xì)菌屬中的豐度占比分別僅為2.55%、2.83%和2.83%。此外，果實(shí)橢圓形番茄植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、甲基桿菌—甲基羅布氏菌屬(Methylobacterium-Methylorubrum)、擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsis)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和未分類(lèi)產(chǎn)堿桿菌屬(norank_f__Alcaligenaceae)；果實(shí)扁平形番茄植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬為鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、未分類(lèi)鹽單胞菌屬(unclassified_f__Halomonadaceae)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、norank_f__Mitochondria、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)和Massilia；果實(shí)長(zhǎng)形番茄植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬為L(zhǎng)eucobacter、未分類(lèi)黃色單胞菌屬(unclassified_f__Xanthomonadaceae)和地微桿菌屬(Geomicrobium)；果實(shí)圓球形番茄植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬為棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、魏斯氏菌屬(Weissella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、unclassified_f__Rhodanobacteraceae和短小桿菌屬(Curtobacterium)；未分類(lèi)的大腸桿菌屬(unclassified_f__Enterobacteriaceae)在果實(shí)長(zhǎng)形番茄植株中不存在，但在果實(shí)橢圓形、圓球形和扁平形番茄植株莖部的細(xì)菌屬中的豐度占比分別達(dá)7.91%、5.12%和3.95%(表3)。

2.4 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部細(xì)菌群落的物種Venn圖分析

由Venn圖分析結(jié)果(圖3)可知，在OTU分類(lèi)水平，果實(shí)橢圓形番茄的植株莖部與其他果形番茄的植株莖部共有內(nèi)生細(xì)菌OTUs為993個(gè)，特有內(nèi)生細(xì)菌OTUs為154個(gè)；果實(shí)扁平形番茄的植株莖部與其他果形番茄的植株莖部共有內(nèi)生細(xì)菌OTUs為951個(gè)，特有內(nèi)生細(xì)菌OTUs為109個(gè)；果實(shí)長(zhǎng)形番茄的植株莖部與其他果形番茄的植株莖部共有內(nèi)生細(xì)菌OTUs為977個(gè)，特有細(xì)菌OTUs為142個(gè)；果實(shí)圓球形番茄的植株莖部與其他果形番茄的植株莖部共有內(nèi)生細(xì)菌OTUs為1057個(gè)，特有細(xì)菌OTUs為184個(gè)；四者共有內(nèi)生細(xì)菌OTUs為501個(gè)。

從圖4可看出，在屬分類(lèi)水平，4種果實(shí)形狀番茄的植株莖部中共有內(nèi)生細(xì)菌屬310個(gè)；果實(shí)橢圓形番茄的植株莖部特有內(nèi)生細(xì)菌屬42個(gè)；果實(shí)扁平形番茄的植株莖部特有內(nèi)生細(xì)菌屬23個(gè)；果實(shí)長(zhǎng)形番茄的植株莖部特有內(nèi)生細(xì)菌屬為38個(gè)；果實(shí)圓球形番茄的植株莖部特有內(nèi)生細(xì)菌屬為49個(gè)。

2.5 PICRUSt功能預(yù)測(cè)

為了獲得不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的功能，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)4種果實(shí)形狀番茄的植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌在一級(jí)功能層共有代謝(Metabolism)、環(huán)境信息處理(Environmental information processing)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular processes)、人類(lèi)疾病(Human diseases)和有機(jī)系統(tǒng)(Organismal systems)6類(lèi)生物代謝通路(圖5)。其中，代謝均為4種果實(shí)形狀番茄的植株內(nèi)生細(xì)菌主要功能組成，在橢圓形、扁平形、長(zhǎng)型和圓球形番茄植株莖部的6類(lèi)生物代謝通路中占比分別為78.16%、77.14%、77.95%和78.82%；環(huán)境信息處理在橢圓形、扁平形、長(zhǎng)型和圓球形番茄植株莖部的6類(lèi)生物代謝通路中占比分別為6.24%、7.07%、6.20%和5.72%；遺傳信息處理在橢圓形、扁平形、長(zhǎng)型和圓球形番茄植株莖部的6類(lèi)生物代謝通路中占比分別為5.75%、5.55%、5.65%和6.06%；細(xì)胞過(guò)程在橢圓形、扁平形、長(zhǎng)型和圓球形番茄植株莖部的6類(lèi)生物代謝通路中占比分別為4.41%、4.81%、4.51%和4.10%；人類(lèi)疾病在橢圓形、扁平形、長(zhǎng)型和圓球形番茄植株莖部的6類(lèi)生物代謝通路中占比分別為3.50%、3.65%、3.76%和3.35%；有機(jī)系統(tǒng)在橢圓形、扁平形、長(zhǎng)型和圓球形番茄植株莖部的6類(lèi)生物代謝通路中占比分別為1.94%、1.78%、1.94%和1.94%?？梢?jiàn)，代謝功能是4種果實(shí)形狀番茄的植株內(nèi)生細(xì)菌最主要功能。此外，橢圓形和圓球形番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的代謝功能預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)高于相應(yīng)的扁平形和長(zhǎng)型番茄；不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基因一級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因種類(lèi)無(wú)顯著差異，但基因拷貝數(shù)占比存在差異。

圖3 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌OTUs分類(lèi)水平的Venn圖分析結(jié)果Fig.3 Venn diagram of endophytic bacteria at OTUs level in stem of tomato plant with different fruit shapes

圖4 不同果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌屬分類(lèi)水平的Venn圖分析結(jié)果Fig.4 Venn diagram of endophytic bacteria at genus level in stem of tomato plant with different fruit shapes

圖5 預(yù)測(cè)功能基因在不同番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌間的差異(一級(jí)功能層)Fig.5 Predicting differences in functional genes among endophytic bacteria in the stems of different tomato plants(hierarchy level 1)

對(duì)4種果實(shí)形狀番茄的植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基因進(jìn)行二級(jí)功能預(yù)測(cè)分析，結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)其二級(jí)功能層均主要由全貌總述圖(Global and overview maps)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、能量代謝(Energy metabolism)、輔因子和維生素的代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)(Membrane transport)、信號(hào)傳導(dǎo)(Signal transduction)、異生物質(zhì)的生物降解和代謝(Xenobiotics biodegradation and metabolism)和細(xì)胞群落—原核生物(Cellular community-prokaryotes)等46個(gè)子功能組成，其中，果實(shí)圓球形番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的全貌總述圖、氨基酸代謝、輔因子和維生素的代謝、類(lèi)脂物代謝作用(Lipid metabolism)和翻譯(Translation)等15個(gè)二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)占比較多；果實(shí)扁平形番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的碳水化合物代謝、能量代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞群落—原核生物等14個(gè)二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)占比較多；果實(shí)長(zhǎng)形番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的異生物質(zhì)生物降解和代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡(Cell growth and death)、癌癥：概述(Cancer:overview)和神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)等13個(gè)二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)占比較多；果實(shí)橢圓形番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的老化(Aging)、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝(Transport and catabolism)、免疫系統(tǒng)(Immune system)和免疫性疾病(Immune disease)4個(gè)二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)占比最多。

綜上所述，雖然4種果實(shí)形狀番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基因的二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因種類(lèi)相近，但基因拷貝數(shù)四者間存在明顯差異。由此推測(cè)，不同果實(shí)形狀番茄植株間內(nèi)生細(xì)菌群落組成、結(jié)構(gòu)及其功能基因種類(lèi)和豐度的差異可能是造成植株內(nèi)部合成代謝途徑、占比、營(yíng)養(yǎng)成分、酶和激素種類(lèi)及其含量水平產(chǎn)生差異的因素，進(jìn)而使得不同番茄品種果實(shí)呈現(xiàn)不同的形狀。

3 討 論

已有研究表明，內(nèi)生細(xì)菌寄居于植物組織中，與寄主植物建立了和諧互作的良好關(guān)系，具有固氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抗病蟲(chóng)害及抗病原真菌等作用，還可改變酶活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)寄主植物的新陳代謝[26-29]；在涉及番茄果實(shí)形狀的4個(gè)基因中，SUN基因編碼IQD家族的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白影響果實(shí)伸長(zhǎng)，OVATE基因編碼OVATE家族蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄而影響果實(shí)伸長(zhǎng)，LC基因主要控制分生組織大小及腔室數(shù)量，F(xiàn)AS基因編碼YABBY家族調(diào)控腔室數(shù)量誘導(dǎo)果實(shí)扁平或卵圓形伸長(zhǎng)，但番茄果實(shí)形狀除受品種基因調(diào)控外，還受營(yíng)養(yǎng)、內(nèi)源激素水平和環(huán)境(光照、溫度和水分)等因素影響[30]。近年來(lái)，隨著人們認(rèn)知水平的不斷提升，已發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)源激素的形成與微生物間存在緊密聯(lián)系，如IAA和CK含量與酸桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)細(xì)菌豐度占比間呈顯著正相關(guān)，與厚壁菌門(mén)細(xì)菌豐度占比呈顯著負(fù)相關(guān)；ABA含量與放線(xiàn)菌門(mén)細(xì)菌豐度占比呈顯著正相關(guān)，與變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)細(xì)菌豐度占比呈顯著負(fù)相關(guān)[31]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

圖6 預(yù)測(cè)功能基因在不同番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌間的差異(二級(jí)功能層)Fig.6 Predicting differences in functional genes among endophytic bacteria in the stems of different tomato plants(hierarchy level 2)

本研究結(jié)果表明，在門(mén)分類(lèi)水平，不同果實(shí)形狀番茄植株莖部的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)類(lèi)均由放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)細(xì)菌組成，但優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)的豐度占比在不同果實(shí)形狀番茄植株莖部表現(xiàn)各異。其中，果實(shí)長(zhǎng)形和扁平形番茄植株莖部中豐度占比最高的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門(mén)為變形菌門(mén)，占比分別達(dá)48.15%和46.97%；果實(shí)橢圓形和圓球形番茄植株莖部中豐度占比最高的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門(mén)為放線(xiàn)菌門(mén)，占比分別達(dá)45.22%和49.28%，而變形菌門(mén)細(xì)菌的豐度占比僅分別為34.28%和28.53%。由于ABA含量與放線(xiàn)菌門(mén)細(xì)菌豐度占比呈正相關(guān)、與變形菌門(mén)細(xì)菌豐度占比呈負(fù)相關(guān)，由此推測(cè)，相比于果實(shí)橢圓形和圓球形番茄品種，果實(shí)長(zhǎng)形和扁平形番茄品種植株莖部可能會(huì)形成ABA含量更高的環(huán)境；內(nèi)源ABA可抑制番茄果實(shí)縱向生長(zhǎng)[32]，因此ABA可調(diào)控番茄果實(shí)形狀傾向于形成橢圓形或圓球形。

乳酸桿菌屬[33]、寡養(yǎng)單胞菌屬[34]、葡萄球菌屬[35-36]和短小桿菌屬[37-38]細(xì)菌是果實(shí)橢圓形或圓球形番茄品種植株莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬。其中，乳酸桿菌屬細(xì)菌是一類(lèi)通過(guò)產(chǎn)生乳酸降低內(nèi)生環(huán)境pH、有益于植株健康的微生物，寡養(yǎng)單胞菌屬細(xì)菌具有ACC脫氨酶活性，可調(diào)控乙烯的合成，進(jìn)而增強(qiáng)植株抗逆性，葡萄球菌屬可將難溶性有機(jī)/無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化成有利于植株吸收的可溶性磷酸鹽，改善作物磷素營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，提高土壤肥力，短小桿菌屬具有固氮能力，可提高植株氮利用率，增加果實(shí)產(chǎn)量的效果。本研究中，在屬分類(lèi)水平，青枯菌屬、假諾卡氏菌屬、短頸細(xì)菌屬、短狀桿菌屬、芽孢桿菌屬和紅球菌屬細(xì)菌均是4種果實(shí)形狀番茄的植株莖部中共有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；果實(shí)形狀不同番茄的植株莖部中也富集了各自特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，其中，果實(shí)橢圓形番茄的植株莖部特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬、甲基桿菌—甲基羅布氏菌屬、擬無(wú)枝酸菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和未分類(lèi)產(chǎn)堿桿菌屬；果實(shí)扁平形番茄的植株莖部特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬為鞘脂單胞菌屬、未分類(lèi)鹽單胞菌屬、擬諾卡氏菌屬、norank_f__Mitochondria、鞘氨醇桿菌屬和Massilia；果實(shí)長(zhǎng)形番茄的植株莖部特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬為L(zhǎng)eucobacter、未分類(lèi)黃色單胞菌屬和地微桿菌屬；果實(shí)圓球形番茄的植株莖部特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬為棒狀桿菌屬、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬、unclassified_f__Rhodanobacteraceae、短小桿菌屬。由此推斷，本研究中果實(shí)橢圓形或圓球形番茄植株莖部能富集有別于果實(shí)長(zhǎng)形或扁平型番茄植株莖部的特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，因此可形成諸如內(nèi)源激素種類(lèi)與含量、汁液pH及植株內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)水平等環(huán)境因子有異于果實(shí)長(zhǎng)形或扁平型番茄植株的內(nèi)部環(huán)境，進(jìn)一步誘導(dǎo)果實(shí)形狀不同番茄品種中不同功能基因表現(xiàn)出顯性或隱性狀態(tài)，促使該環(huán)境下“啟動(dòng)”的功能基因調(diào)控形成不同形狀的番茄果實(shí)。

4 結(jié) 論

4種果實(shí)形狀番茄的植株莖部均富集共有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，各自還富集了特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，但共有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的豐度占比各異。其中，特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬及其代謝功能參與調(diào)控或影響番茄果實(shí)形狀的形成進(jìn)程。因此，番茄植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落特征有望作為指示番茄果實(shí)形狀的生物學(xué)指標(biāo)。