高 攀，石永強(qiáng)（通訊作者），趙向陽(yáng)，王小平，陳 躍，王 輝，吳新國(guó)，荊 揚(yáng)，宋用強(qiáng)

（南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 江蘇 南京 211200）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）是一種主要侵犯結(jié)直腸黏膜以及黏膜下層病因不明確腸道非特異性、慢性炎癥，主要的臨床特征表現(xiàn)是腹痛、腹瀉以及黏液膿血便。在我國(guó)UC 患者中，以中年患者居多。UC 的臨床特征表現(xiàn)是慢性復(fù)發(fā)性，過程中表現(xiàn)為受累腸黏膜炎癥浸潤(rùn)或消退[1]。近年來，我國(guó)UC 的發(fā)病率和患病率表現(xiàn)出快速上升態(tài)勢(shì)，且因其病程長(zhǎng)、難治愈，公認(rèn)為難治性疾病之一。UC 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，仍需進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，UC 的形成與發(fā)展是菌群失調(diào)、免疫紊亂、宿主易感等多種因素相互作用的結(jié)果，腸黏膜慢性炎癥持續(xù)存在是其顯著的特點(diǎn)[2]。細(xì)胞焦亡是新發(fā)現(xiàn)一種依賴于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific protease 1, Caspase-1）介導(dǎo)促炎程序性細(xì)胞死亡方式，主要表現(xiàn)形式為細(xì)胞腫脹裂解并且釋放大量促炎因子。而Caspase-1 活化需要NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor family, Pyrin domain containing protein 3, NLRP3）炎性小體誘導(dǎo)。目前提出NLRP3 炎癥小體的重要作用表現(xiàn)在調(diào)節(jié)腸道炎性反應(yīng)、識(shí)別腸道共生菌、維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面，NLRP3 炎癥小體失調(diào)對(duì)UC 的發(fā)病起到一定作用[3]。本研究通過觀察Caspase-1 信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞焦亡相關(guān)因子在UC 患者結(jié)腸黏膜中變化，旨在探討UC 可能發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在治療新靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月—2019 年6 月在南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院門診診治UC 患者80 例作為UC 組。根據(jù)患者腸黏膜病理分級(jí)將UC 組分別劃為Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組和Ⅲ級(jí)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)內(nèi)鏡病理確診的UC[4]；②簽署知情同意書。排除主要指標(biāo)：感染性結(jié)腸炎；合并其他重要臟器嚴(yán)重疾病；哺乳及妊娠期婦女；藥物過敏者。其中男性39 例，女性41 例，平均年齡（40.62±6.18）歲，平均病程（4.15±2.73）年。選擇同時(shí)期內(nèi)健康體檢者或者是結(jié)腸單發(fā)息肉切除術(shù)后復(fù)查內(nèi)鏡為正常者作為對(duì)照組40名，男性24名，女性16名，平均年齡（38.69±7.25）歲。

1.2 標(biāo)本采集

在患者病變最為明顯腸段黏膜潰瘍邊緣或充血水腫最明顯處多點(diǎn)取材（6 ～8 個(gè)點(diǎn)）。正常對(duì)照組都是在乙狀結(jié)腸處取材（6 ～8 個(gè)點(diǎn)）?；顧z組織一部分通過10%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行HE 染色，觀察組織學(xué)形態(tài)并進(jìn)行病理分級(jí)。另一部分檢標(biāo)本放入液氮冷凍，備檢。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

UC 患者組織切片均是通過病理科2 位經(jīng)培訓(xùn)且取得相關(guān)資格認(rèn)證的醫(yī)師閱片，按Truelove-Richards 標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)。Ⅰ級(jí)：沒有顯著炎癥；Ⅱ級(jí)：輕至中度炎癥；Ⅲ級(jí)：重度炎癥。采用Southerland 疾病活動(dòng)指數(shù)（Mayo 指數(shù)）評(píng)分系統(tǒng)[6]評(píng)估UC 疾病活動(dòng)性，進(jìn)行疾病分期。

1.4 相關(guān)因子檢測(cè)

將活檢組織制成組織勻漿，取上清。采用Western blot 檢測(cè)NLRP3、Caspase-1 在腸黏膜表達(dá)。采用ELISA法檢測(cè)白介素1β（interleukin-1 β, IL-1β）、白介素18（interleukin-18, IL-18）在腸黏膜表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；相關(guān)分析采用Spearman 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 UC 組患者結(jié)腸黏膜組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)

UC 組結(jié)腸黏膜組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較來看均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。UC 結(jié)腸黏膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)跟隨組織病理分級(jí)增高從而逐步增強(qiáng)，Ⅲ級(jí)＞Ⅱ級(jí)＞Ⅰ級(jí)，組間方差分析表明，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組結(jié)腸黏膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)及和組織病理分級(jí)比較（± s）

表1 各組結(jié)腸黏膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)及和組織病理分級(jí)比較（± s）

組別 例數(shù)NLRP3Caspase-1觀察組Ⅰ級(jí)組 240.52±0.080.51±0.07Ⅱ級(jí)組 401.07±0.091.04±0.09Ⅲ級(jí)組 161.63±0.181.58±0.15對(duì)照組400.52±0.080.59±0.07 P＜0.05＜0.05組別 例數(shù)IL-1β/（pg·mL-1）IL-18/（pg·mL-1）觀察組Ⅰ級(jí)組 2428.47±8.06151.32±21.08Ⅱ級(jí)組 4046.15±8.82257.16±34.29Ⅲ級(jí)組 1675.24±9.15427.69±61.74對(duì)照組4022.17±5.03136.85±11.62 P＜0.05＜0.05

2.2 相關(guān)性分析

Spearman 秩相關(guān)分析顯示，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)與Mayo 評(píng)分均存在正相關(guān)關(guān)系，r值分別為0.706、0.712、0.867、0.836；（P＜0.05）。

3.討論

UC 是一種復(fù)雜的、由多種因素引起的疾病，其特征為可能涉及整個(gè)腸道慢性、復(fù)發(fā)性、進(jìn)行性炎癥；盡管該病病因仍然不明確，目前認(rèn)為個(gè)人遺傳易感性、外部環(huán)境、內(nèi)部腸道微生物群、宿主免疫應(yīng)答在內(nèi)等因素是造成UC 發(fā)病的主要原因，而有證據(jù)表明UC 可能由遺傳易感個(gè)體對(duì)腸道微生物群的異常和持續(xù)免疫反應(yīng)造成[7]。細(xì)胞焦亡已被研究證明，是一種新發(fā)現(xiàn)的、由Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡方式，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分為兩種，一種為Caspase-1 介導(dǎo)的經(jīng)典通路；和Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導(dǎo)的非經(jīng)典通路；細(xì)胞焦亡的特點(diǎn)是質(zhì)膜快速破裂，然后釋放出細(xì)胞內(nèi)容物和大量促炎物質(zhì)，進(jìn)而引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而造成細(xì)胞的損傷[8]。細(xì)胞焦亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種炎癥相關(guān)的細(xì)胞程序性死亡形式，過程伴隨細(xì)胞的脹破，細(xì)胞內(nèi)促炎物質(zhì)的排出，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡以及程序性壞死等形式共同調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡過程，有研究表明，細(xì)胞焦亡參與過敏性疾病、感染性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、痛風(fēng)等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。NLRP3 炎癥小體主要功能活化Pro-Caspase-1，使其具有酶活性，激活Caspase-1 對(duì)促炎細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 前體進(jìn)行加工，促使其成熟并釋放到細(xì)胞外，從而發(fā)揮促炎作用[10]。

細(xì)胞焦亡過程需要活化Caspase-1，而Caspase-1一個(gè)主要作用是介導(dǎo)IL-1β 前體裂解成具有活性IL-1β，其功能為募集、激活機(jī)體免疫細(xì)胞，促進(jìn)趨化因子、炎癥因子、黏附分子等合成，最終形成“瀑布效應(yīng)”“級(jí)聯(lián)效應(yīng)”，從而引起劇烈炎癥反應(yīng)[11]。由此，細(xì)胞焦亡一定會(huì)引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，細(xì)胞焦亡水平一定程度上反映機(jī)體炎癥反應(yīng)水平，兩者相互聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，UC 腸黏膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)均上調(diào)，并隨UC 病理分級(jí)升高而表達(dá)升高，提示炎癥越重，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)越強(qiáng)。同時(shí)，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 與UC 患者M(jìn)ayo 評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系，提示UC 疾病活動(dòng)度越高，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)越強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，使用NLRP3 依賴的pro-Caspase-1、IL-1b 和IL-18 的抑制劑Fclla-2 治療小鼠，能夠減輕急性結(jié)腸炎[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，將野生型（WT）C57BL/6 小鼠與NLRP3 基因敲除純合子C57BL/6小鼠給予DSS 誘導(dǎo)，比較各組腸道黏膜組織病理評(píng)分、NLRP3 炎癥小體及閉鎖小帶蛋白-1、閉鎖蛋白水平、IL-1β、及IL-18 水平、血清中二胺氧化酶及D-乳酸水平的差異，研究發(fā)現(xiàn)：敲除NLRP3 基因?qū)SS 誘導(dǎo)的小鼠UC 具有保護(hù)作用，其能改善腸道黏膜屏障功能和改善腸道黏膜組織病理[14]。此外，還有研究表明NLRP3 炎癥小體對(duì)TNF-α、IFN-γ、IL-10、TGF-β、干擾素誘導(dǎo)蛋白10、髓過氧化物酶、β-防御素和腸道菌群均有影響[15]。有研究表明，NLRP3 炎癥小體的活化與UC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，NLRP3 炎癥小體活化的治療方案可能是防治UC 的有效手段[16]。值得注意的是，中草藥中一些有效成分，如黃酮類、萜類、生物堿類等，同樣具有抗UC 的作用，其具有多通路、多靶點(diǎn)的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤的作用，且其優(yōu)勢(shì)在于來源廣泛、不良反應(yīng)小、療效確切等?；颊叩囊缽男暂^高、并且復(fù)發(fā)率低，能減少患者對(duì)藥物的依賴，提高患者生活質(zhì)量，故深入研究中藥調(diào)控NLRP3 炎癥小體的作用機(jī)制，可能為防治UC 提供新的方式和方法[17]。

綜上所述，UC 腸黏膜中Caspase-1 信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞焦亡相關(guān)因子表達(dá)均上調(diào)，并隨UC 病理分級(jí)的升高而表達(dá)增強(qiáng)。Caspase-1 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡可能在UC 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，推測(cè)該作用通過NLRP3 炎癥小體激活Caspase-1 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，進(jìn)而增加IL-1β、IL-18、IL-17 分泌而實(shí)現(xiàn)，未來可能成為UC 治療作用靶點(diǎn)。